地桃花质量标准的研究

陈 贵，夏稷子，徐作刚，史 娟，邓言欢，张 华，王 涛，安 军

（黔南州检验检测院，贵州 都匀558000）

地桃花为锦葵科梵天花属植物地桃花Urena lobataL.的干燥全草，具有祛风利湿、活血消肿、清热解毒的功效，主治感冒、风湿痹痛、跌打肿痛、毒蛇咬伤等［1-3］，主要含有黄酮、有机酸、多酚，功效抗氧化、抗菌、抗炎等［4-10］，其中黄酮类化合物银锻苷有着显著的抗氧化、抗炎作用［11-12］。1990年版《广西中药材标准》 和2009年版《湖南中药材标准》 收载了地桃花，其入药部位为地上部分，但其质量控制指标仅有性状和水分，尚无显微鉴别、薄层鉴别、浸出物、成分含有量测定等项目［13-14］；苏聪等［15］采用HPLC 法测得广西、广东产地桃花地上部分银锻苷含有量范围为0.010%～0.064%。本实验对12批地桃花进行性状鉴定及显微、TLC 鉴别，测定水分、总灰分、浸出物含有量，并建立HPLC 法测定银锻苷含有量，为该药材质量控制提供依据。

1 材料

DM2500型显微镜（德国Leica 公司）；LC-2010A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；双光束TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；AG135型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BSA224S 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；HH-6型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；SK250LHC 型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；101-1AB 型电热鼓风干燥箱、SX-4-10型箱式电阻炉（天津市泰斯特仪器有限公司）。银锻苷对照品（批号170305，含有量99.34%），购于北京世纪奥科生物技术有限公司。G 型硅胶板（青岛海洋化工有限公司，批号20 180621；青岛基亿达硅胶试剂厂，批号20150910）；H 型硅胶板（青岛海洋化工有限公司，批号20160226）。乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯；水为娃哈哈纯净水。地桃花于2015至2016年采自贵州都匀、兴仁、思南等地，经贵州省食品药品检验所中药标本馆李杨馆长鉴定为锦葵科植物地桃花Urena lobataL.的干燥全草，具体见表1。

2 方法与结果

2.1 形态鉴定［1］药材根呈圆柱形，略弯曲，支根少数，上生多数须根，表面淡黄色，具纵皱纹，质硬，断面呈破裂状；茎下部棕黑色至棕黄色，上部灰绿色至暗绿色，具粗浅的网纹，质硬，木部断面不平坦，皮部纤维性；叶多已破碎，完整者多皱缩，上表面深绿色，下表面粉绿色，密被短柔毛和星状毛，掌状网脉，中脉基部有一腺体，叶腋常有宿存的托叶；具花者花梗长约3 mm，被绵毛；小苞片5，长约6 mm，基部1／3合生；花萼杯状，裂片5，较小苞片略短；花瓣多皱缩，常脱落；具果者果扁球形，每一分果呈球状五等分楔形，具星状短柔毛和锚状刺，种子肾形；气微，味淡。见图1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

图1 地桃花形态鉴定Fig.1 Morphological identification of U.lobata

2.2 显微鉴定 药材粉末呈黄绿色或棕黄色；色素块棕黄色或棕红色，形状不规则；单细胞非腺毛众多，单生或2～8个星状簇生，平直或稍弯曲；腺毛头部3～9细胞，柄部1～2细胞；纤维成束或散在，壁厚；气孔平轴式；草酸钙簇晶多见，直径10～50 μm；导管多为孔纹导管和螺纹导管。见图2。

图2 地桃花显微鉴定Fig.2 Microscopic identification of U.lobata

2.3 TLC 定性鉴别［16-17］取药材粉末1 g，加80%甲醇25 mL，水浴回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加2 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液；取适量银锻苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含该成分约0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。按2015年版《中国药典》 四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照品溶液1 μL、供试品溶液2 μL，点于同一G 型硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（30 ∶1 ∶3 ∶0.5）的上层溶液为展开剂，置于展开缸中展开，取出后晾干，喷以三氯化铝试液，并用热风吹干，于365 nm 紫外光灯下检视，结果见图3。由图可知，在供试品、对照品色谱相应位置上显相同的黄绿色荧光斑点。

图3 地桃花TLC 色谱图Fig.3 TLC chromatogram of U.lobata

2.4 检查项及浸出物［18］采用2015年版《中国药典》 四部通则0832水分测定法第二法（烘干法）测定含水量，通则2302总灰分测定法测定总灰分含有量，通则2201项下醇溶性浸出物测定法（热浸法）测定浸出物含有量（溶剂为乙醇），平行3份，结果见表2。根据测定结果，初步拟定含水量不得超过15.0%，总灰分含有量不得超过11.0%，浸出物含有量不得少于5.0%。

2.5 含有量测定

2.5.1 色谱条件 岛津InertSustain® C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1% 冰醋酸（22 ∶ 78）；柱 温 30 ℃；体积流量1.0 mL／min；检测波长315 nm；进样量10 μL，色谱图见图4。在此条件下，银锻苷理论塔板数大于6 000，与相邻成分色谱峰的分离度大于1.5。

表2 水分、总灰分、浸出物含有量测定结果（n=3）Tab.2 Results of content determination of water，total ash and extract（n=3）

图4 银锻苷HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of tiliroside

2.5.2 对照品溶液制备 取对照品11.99 mg，置于50 mL 量瓶中，加入80%甲醇，即得（每1 mL含238.2 μg 银锻苷）。

2.5.3 供试品溶液制备 精密称取药材粉末（过3号筛）约1 g，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，水浴回流提取1 h，放冷，80%甲醇补足减失的质量，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.5.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1 mL，置 于2、10、50、250、500 mL 量瓶中，80%甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得到方程为Y=31 242X＋475（r=1.000 0），在0.476 4～238.2 μg／mL范围内线性关系良好。

2.5.5 精密度试验 取“2.5.4”项下同一质量浓度对照品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样6次，测得银锻苷峰面积RSD 为0.14%，表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验 取药材粉末（批号161014），按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.5.1”项色谱条件下进样，测得银锻苷含有量RSD 为0.56%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.7 重复性试验 取药材粉末（批号161014）6份，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样，测得银锻苷含有量RSD 为0.28%，表明该方法重复性良好。

2.5.8 加样回收率试验 取4.87 mg 对照品于200 mL 量瓶中，80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL 含24.2 μg 该成分的贮备液。精密称取含有量已知的药材（批号161014）6份，每份0.5 g，精密加入贮备液15 mL、80% 甲醇10 mL，称定质量后水浴回流提取1 h，放冷，80%甲醇补足减失的质量，微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 银锻苷加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for tiliroside（n=6）

2.5.9 样品含有量测定 取不同产地药材粉末各约1 g，按“2.5.3”项下方法平行制备3份供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表4。由表可知，除了1批样品中银锻苷含有量较低，仅为0.130 mg／g 外，其余各批均高于0.300 mg／g，故初步拟定其限度不得低于 0.300 mg／g，即按干燥品计算不得低于0.030%。

表4 银锻苷含有量测定结果（n=3）Tab.4 Results of content determination of tiliroside（n=3）

3 讨论

3.1 TLC 法耐用性考察 本实验考察了温度（4、25、40 ℃）、相对湿度（30%、52%、80%）、厂家、类型（G 型、H 型）薄层硅胶板对银锻苷TLC鉴别的影响，发现各厂家G 型硅胶板在不同温度、相对湿度下，TLC 色谱图中银锻苷斑点清晰，与相邻斑点分离度较好，而H 型硅胶板效果较差，故选择G 型板。

3.2 检测波长选择 银锻苷检测波长包括266 nm［19］、315 nm［20-21］、316 nm［22］等，其中在265、315 nm处有最大吸收。本实验结合HPLC 色谱图中银锻苷吸收强度、相邻峰干扰等因素，最终选择315 nm作为检测波长。

3.3 流动相选择 本实验参考文献［15］报道，将水相用0.1%冰醋酸替代，可使银锻苷色谱峰对称性更好。同时，用等度洗脱代替梯度洗脱时，操作更简便，所得色谱峰基线更平稳。

3.4 提取条件选择 本实验考察了提取方式（回流、超声）、提取时间（30、60、90 min）、提取溶剂（90%、80%、70%、60% 甲醇，甲醇和稀乙醇）对银锻苷提取的影响，发现80% 甲醇回流提取60 min 时效率较高。

3.5 粉末用筛选择 本实验考察了筛网（2号、3号）对银锻苷含有量测定的影响，发现2号筛处理后药材含有大量纤维，粉末均匀性较差，平行样偏差易超出范围；3号筛处理后既能保证取样均匀，又有较高的得粉率，故选择3号筛。

3.6 HPLC 法耐用性考察 本实验考察了岛津InertSustain® C18、Waters Symmetry® C18、Agilent ZORBAX SB-C18、AlltimaTMC18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱 温（20、25、30、35、40 ℃），色谱仪（LC-2010A、Agilent 1260），发现柱温对银锻苷检测影响较大，在20、25、30 ℃时峰形对称性理想，可与相邻峰达到基线分离，含有量测定结果无明显差异；在35、40 ℃时出峰时间变短，与相邻峰未达到基线分离。

4 结论

本实验对地桃花性状、显微、TLC 定性鉴别、HPLC 含有量测定进行较为全面的研究，可为有效控制该药材质量提供科学依据，同时也为相关地方标准的制定及现有质量标准的提升提供参考。