HPLC 法同时测定两粤黄檀中6种成分

宋 舸，韦建华，陈 瑾，张妍妍，王慧敏，冯 旭

（广西中医药大学，广西南宁530001）

两粤黄檀Dalbergia benthamiiPrain.为蝶形花亚科黄檀属植物，藤本，有时为灌木。枝长，干时黑色，具有通经活血的作用，常用于治疗跌打损伤、筋骨疼痛等［1］。张礼行等［2］通过GC-MS 技术发现其中含有丁香酚甲醚、异丁香酚甲醚、榄香素等10种成分。韦建华等［3］通过柱色谱、重结晶等方法分离获得14个化合物。霍丽妮等［4］对比95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物发现，乙酸乙酯部位有相对优异的抗氧化能力，并通过与阿卡波糖的对比，发现乙酸乙酯部位对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用。陈思思等［5］用二倍稀释法考察发现两粤黄檀粗提物具有一定的抗菌作用，通过二甲苯、鸡蛋清致模型肿胀发现其具有一定的抗炎作用。鉴于两粤黄檀中相关活性成分复杂，单一含有量测定难以达到质量控制的要求。因此，本研究建立了两粤黄檀中6种成分含有量同时测定的方法，以期为其质量控制提供更加全面、科学的依据。

1 材料

TGL-16B 高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TM-D 24UV 超纯水仪（德国Millipore 公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；KQ5200B 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；安捷伦1260高效液相色谱仪（VWD 检测器，四元高压梯度泵，美国安捷伦公司）；SQP 电子天平［德国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

甘草酸对照品（批号G-003-191220）、甘草次酸对照品（批号G202002）购自合肥博美生物科技有限公司；土甘草A 对照品、4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮对照品、大鱼藤树素甲醚对照品［3，6］、大鱼藤树酸甲酯对照品［3，7］（自制，归一化法含有量在98%以上）。氯仿（分析纯，西陇化工股份有限公司）；水为超纯水；乙腈（德国默克公司）、甲醇（Fisher）、磷酸（西陇化工股份有限公司）均为色谱纯。两粤黄檀，信息见表1，经广西中医药大学壮医药学院韦松基教授鉴定为豆科植物黄檀属两粤黄檀Dalbergia benthamiiPrain.植物的茎。打粉过40目筛。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters-symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-甲醇（B）-0.2%磷酸（C），梯度洗脱，程序见表2；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长256 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，加甲醇定容。配制各对照品质量浓度分别为甘草酸1.25 mg／mL、土甘草A 0.573 mg／mL、4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮0.276 mg／mL、大鱼藤树素甲醚 0.124 mg／mL、大鱼藤树酸甲酯0.120 mg／mL、甘草次酸0.180 mg／mL。

2.2.2 供试品溶液 精密称取药材粉末1.0 g，精密加20 mL 氯仿，超声（200 W、40 kHz）60 min，冷却后用氯仿补足减失质量，滤过，精密量取2 mL 滤液挥干后用甲醇定容至2 mL，微孔滤膜过滤。

2.3 线性关系考察 配制不同质量浓度的对照品溶液，在“2.1”项条件下连续进样，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归。结果见表3。表明各成分在各自范围内线性关系良好［8］。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项条件下连续进样6次，甘草酸、土甘草A、4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮、大鱼藤树素甲醚、大鱼藤树酸甲酯、甘草次酸峰面积RSD 分别为0.54%、0.34%、0.45%、1.3%、0.45%、0.53%。表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号S7），在“2.1”项条件下，分别于2、4、6、8、10、12 h 进样，甘草酸、土甘草A、4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮、大鱼藤树素甲醚、大鱼藤树酸甲酯、甘草次酸RSD 分别为0.82%、0.51%、0.68%、0.60%、0.52%、1.4%。表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.6 重复性试验 取6份两粤黄檀药材（批号S7）平行3次，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，甘草酸、土甘草A、4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮、大鱼藤树素甲醚、大鱼藤树酸甲酯、甘草次酸含有量RSD 分别为 0.78%、0.81%、0.85%、1.7%、0.84%、0.80%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 精密称取9份（批号S7，每份约0.50 g），分别按照药材含有量的50%、100%、150%加入混合对照品溶液（质量浓度分别为0.591 6、0.263 4、0.130 8、0.058 6、0.056 8、0.085 3 mg／mL）5.00、10.00、15.00 mL［6］。精密加入甲醇至20 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样。结果见表4。

2.8 样品含有量测定 取不同产地的两粤黄檀药材样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，计算各产地6种成分的含有量，结果见表5。

3 讨论

3.1 指标成分选择 前期本实验对两粤黄檀氯仿部位进行液相分离制备获得7种成分，对4种未知成分分别鉴定为甘草酸、大鱼藤树素甲醚、大鱼藤树酸甲酯、甘草次酸。3种已知成分为土甘草A、4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮、异甘草素［3］，其中异甘草素于6 min 出峰不能与其他杂质峰完全分离且含有量较少，无法达到分析要求。而甘草酸、土甘草A、4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮、大鱼藤树素甲醚、大鱼藤树酸甲酯、甘草次酸，各成分在各产地含有量均符合分析要求，故将该种成分作为分析指标。

3.2 供试品制备方法

3.2.1 提取溶剂 分别采用水、甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿，7种溶剂进行考察。分别计算6种成分的含有量。其中，氯仿提取效果较好。

3.2.2 提取条件 分别采用超声、回流、冷浸3种方法，相同体积氯仿提取进行考察。计算6种成分的含有量。其中超声提取和回流提取效果较好，但超声提取效果略好于回流提取。

3.2.3 提取时间 分别用氯仿进行30、60、90、120 min 超声提取，计算6种成分的含有量。其中超声60 min 和120 min 提取效果较好且接近，综合其他因素考虑选用60 min 提取较为合理。

表4 各成分加样回收率试验结果（n=9）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

表5 各成分含有量测定结果（mg／g， n=3）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

3.2.4 料液比 分别考察了1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50不同料液比。计算6种成分的含有量。其中1 ∶20的含有量均明显高于其他比例。

3.3 测定条件选择

3.3.1 色谱柱 本实验分别采用依利特、Waters、热电、Inerstil 等不同厂家色谱柱，其中Waters 分离效果最好，重复性好，故采用该色谱柱。

3.3.2 流动相 由于各成分极性差异较大，等度洗脱难以达到分离要求，所以采用梯度洗脱，其中甲醇和0.2%磷酸梯度洗脱虽然达到分析要求，但保留时间过长，所以采用乙腈、甲醇、0.2% 磷酸3相梯度洗脱。

3.3.3 测定波长 将供试品溶液进行全波长扫描，根据6种成分各最大吸收波长（甘草酸251 nm；土甘草A 260 nm；4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮256 nm；大鱼藤树素甲醚270 nm；大鱼藤树酸甲酯270 nm；甘草次酸264 nm）及各产地6种成分含有量差异、各峰峰形等，确定检测波长为256 nm［9］。

4 结论

中药成分复杂多样，研究单一成分难以对其定性定量分析，不能全面的对中药材进行系统的质量控制，所以本实验采用多成分定量分析［10］。其中采用HPLC 定量测定干扰较少、灵敏度高、结果准确、重复性好。本实验首次对两粤黄檀药材当中的6种成分进行同时测定。结果表明，各产地成分差异较为明显，其中4′-羟基-6-羟甲基-5，7-二甲氧基异黄酮含有量差异非常明显；药材中所含的新黄酮类化合物为大鱼藤树素甲醚、大鱼藤树酸甲酯等，目前研究发现具有新黄酮类母核的化合物具有较强的药理活性［11-12］。后续将结合药效学进行研究，以期为两粤黄檀质量控制方法的建立，提供一定的科学依据。