HPLC 法同时测定不同品种红花中4种黄酮类

马梦雪，吴士筠，李 刚，覃 瑞，董 翔，刘 虹

（中南民族大学生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北重点实验室，湖北 武汉430074）

红花Carthamus tinotoriusL.属菊科红花属的一年生或两年生草本植物，又名刺红花、菊红花和红花菜等，是一种药食同源的重要经济作物［1］。红花适应性较强，能抗寒、耐旱、耐盐碱［2］，在世界各地均有分布，哈萨克斯坦和印度是其主产国［3］。在我国，红花的种植地区几乎遍布全国25个省市（自治区），河南、四川、浙江、云南和新疆为主产区［4］。红花的花瓣作为传统的中草药始载于《开宝本草》，《本草纲目》 记载其具有活血通经、去瘀止痛的功效［5］。现代药理研究表明，红花及其活性成分具有广泛的生物活性，包括扩张冠状动脉、改善心肌缺血、调节免疫系统、抗凝和抗血栓形成、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血脂、镇痛等［6-10］。黄酮类是其最主要的化学成分，根据结构的不同，可以将其分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮、查尔酮、花色素等。羟基红花黄色素A 是红花中主要的查尔酮类，也是其活血化瘀功效的主要有效成分；槲皮素及其苷类芦丁为黄酮醇类，是其抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用的主要活性成分［11］；木犀草素是具有代表性的天然黄酮，具有消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种药理活性［12］，但红花中木犀草素研究相对较少，花中木犀草素的含有量测定尚未见报道。

中药质量是对中药有效性和安全性的反映和表征，刘昌孝等［13］于2016年提出中药质量标志物这一新概念，它是指存在于中药材和中药产品中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质。2010年版《中国药典》 中仅以羟基红花黄色素A 和山柰素为指标用于红花药材的质量控制，不能反映其多成分多靶点的特点，难以全面反映药材质量［14］。故本研究以黄酮类为主要研究对象，以羟基红花花色素A、芦丁、木犀草素和槲皮素为质量标志物，采用HPLC 法同时测定不同品种红花中4种黄酮类的含有量，以期为红花优良品种的选育及红花药材内在质量的控制提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260LC 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，美国安捷伦公司）；KQ-100E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AL-204分析天平（美国梅特勒-托利多公司）；电热恒温鼓风干燥箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）；JK-WB400水浴锅（上海精密科学仪器有限公司）；溶剂过滤器、0.45 μm 微孔过滤膜、一次性针头过滤器等（天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 材料 以62份不同品种红花为材料，种子由中国农业科学院油料作物研究所提供，信息见表1。取材于中南民族大学红花种植基地，并于实验室内用镊子取下花瓣，50 ℃烘箱内烘干至恒定质量，粉碎，过50目筛，备用。羟基红花黄色素A（批 号 R25A9F59977 ）、槲皮素（批 号C09S8Y43412）、芦丁（批号Y16M9S61523）、木犀草素（批号C24M8Q36543）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯购于西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；其他生化试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.5%乙酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，10%～40% A；15～20 min，40%～70% A；20～30 min，70%～10% A）；检测波长300 nm；柱温25 ℃；体积流量0.5 mL／min；进样量10 μL。色谱图见图1。

2.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、木犀草素对照品2.5 mg，甲醇溶解并定容至25 mL 棕色量瓶中，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即为0.1 mg／mL对照品贮备液。准确吸取各对照品贮备液适量于10 mL 棕色量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀，过滤，取续滤液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 供试品溶液制备 称取烘干的红花样品粉末（过50目筛）0.3 g 于100 mL 圆底烧瓶中，加入12 mL 60%甲醇溶液，称定质量，于80 ℃加热回流40 min，放冷，用60% 甲醇补足减失质量，摇匀，过滤，备用。精密移取2 mL 滤液于10 mL 棕色量瓶中，用60% 甲醇稀释至刻度，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液适量，依次逐级稀释，定容，摇匀，制得6个质量溶度梯度的对照品混合溶液。在“2.1”项色谱条件下进样，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取“2.2”项下混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，测得羟基红花黄色素A、芦丁、木犀草素、槲皮素峰面积 RSD 分别为 0.530%、0.608%、0.926%、0.930%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称取安徽红花粉末（AH-1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件 下，分别于0、6、12、18、24 h 进样，测得羟基红花黄色素A、芦丁、木犀草素、槲皮素峰面积RSD 分别为1.108%、0.486%、1.041%、0.721%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取安徽红花粉末（AH-1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样，测得羟基红花黄色素A、芦丁、木犀草素、槲皮素峰面积RSD 分别为0.803%、1.835%、1.562%、0.678%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 称取6份已知含有量的红花粉末，分别精密加入一定质量的羟基红花黄色素A、芦丁、木犀草素和槲皮素对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.9 样品含有量测定 取62份红花供试品溶液，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液各3份，在“2.1”项色谱条件下进样，计算4种黄酮类的含有量，结果见表4。同时，运用SPSS 21.0软件对4种成分含有量四项指标的数据进行标准化处理，结果见表5。

表4 各成分含有量测定结果（， n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n=3）

表4 各成分含有量测定结果（， n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n=3）

表5 黄酮类成分含有量指标统计量分析（%）Tab.5 Index statistics analysis of flavonoids content（%）

3 讨论

3.1 流动相选择 黄酮类化合物易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂。为了同时检测红花中4种黄酮类，同时保证有较好的分离效果，考察了甲醇-水、甲醇-0.4% 磷酸、甲醇-乙腈-0.7%磷酸、甲醇-0.5%乙酸及乙腈-0.5% 乙酸等流动相［15-18］。结果表明，使用前几种流动相系统时，4种组分与其他成分分离度不高，分离所需时间也较长。在选择乙腈-0.5%乙酸为流动相梯度洗脱时，4种黄酮类分离效果较好。

3.2 检测波长选择 通过对对照品溶液波长的扫描，得到各对照品分别在402、370、350、320 nm处有最大吸收，因此考察这4种波长的检测灵敏度。结果发现300、350 nm 条件下检测灵敏度较高，300 nm 作检测波长较350 nm 的干扰峰小，效果最好。因而选择300 nm 为最佳检测波长。

3.3 供试品制备方法考察 采用加热回流法，以总黄酮的提取率为考察指标，对提取溶剂（20%、40%、60%甲醇）、料液比（1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60）、提取温度（60、70、80 ℃）和提取时间（60、80、100 min）进行正交试验考察。结果表明，1.0 g 红花粉末中加入40 mL 60%甲醇回流提取80 min 时总黄酮的提取得率较高。

3.4 指标成分分析 本研究以4种成分对红花品质进行多指标分析，由含有量测定结果可知各品种红花的羟基红花黄色素A 含有量平均值为0.937%～3.847%，其中仅有YN-14和IND-2的值低于1%，其余60份红花的羟基红花黄色素A 含有量均符合2010年版《中国药典》 不少于1% 的要求。由统计量分析结果可知，羟基红花黄色素A 含有量平均值为1.817%，最高含有量（3.847%）是最低含有量（0.937%）的4.10倍；芦丁含有量平均值为0.350%，最高含有量（0.736%）是最低含有量（0.047%）的15.66倍；木犀草素含有量平均值为0.069%，最高含有量（0.142%）是最低含有量（0.016%）的8.875倍；槲皮素含有量平均值为0.788%，最高含有量（1.932%）是最低含有量（0.022%）的87.81倍；4种黄酮类含有量的平均变异系数为42.092%，表明红花植物种内不同品种之间黄酮含有量存在较大差异，分化明显，该结果与郭美丽等［19］对红花种质资源的品质评价的研究结果相似，这为高品质红花品种的遗传选育提供了依据。印度红花（IND-1）、山东红花（SD-2）、德国红花（DEU-1）和叙利亚红花（SYR-1）的羟基红花黄色素A 含有量最高，分别为3.847%、3.369%、3.202%、2.869%，均高于刘雅新等［20］测得的含有量；而且芦丁和槲皮素含有量也较高，表明这些地区的红花资源质量较优，适宜作为红花育种的候选材料。木犀草素主要存在于植物的叶、茎和枝干中，已在菊花中测得，但在红花中尚未有相关报道［21］。本研究从花中测得木犀草素，发现其含有量平均值为0.069%，远远低于其他黄酮类成分含有量，但是该值与韩炜等［22］在红花地上部分测得的木犀草素的平均含有量0.0549%相近，表明木犀草素含有量低可能是因为其本就在红花中含有量相对较少，而与所选取的植物部位无关。由于长期的自然和人工选择，红花品种中化学成分和药理活性在种内发生了变异。一些来源相同的红花品种其黄酮含有量表现出较大的差异，如源自云南的YN-14，其各项黄酮类成分含有量均低于其他云南红花。同时，有一些来自不同地区的红花其黄酮成分含有量表现出相似性，如以色列红花（ISR-1）与阿根廷红花（ARG-1），这可能是因为这些红花资源种植在同一环境条件下时，其在性状上表现出相似的生态适应性。以上结果表明，不同品种红花黄酮含有量可能存在显著性差异，也可能存在相似性，故对红花中多种黄酮类进行同步测定以更加全面的反映其内在质量。

据现有报道［23-24］，红花有不同的花色，不同品种红花在不同的开花时期其花色会发生改变，不同花色的红花其黄酮类成分含有量和药效也存在一定的差异，但是相关作用机制的研究报道甚少，亦有待研。