十三味菥蓂丸质量标准的提升

次旦多吉，巴桑卓嘎，达娃卓玛

（西藏自治区食品药品检验研究院，西藏自治区藏药标准化研究重点实验室，西藏 拉萨850000）

十三味菥蓂丸是藏族验方，最初由藏医药学者嗒布拉吉研制，其配方和功能主治记载于公元十九世纪著名藏医药学家贡追·云旦加措编著的《临床札记》 中，并沿用至今，收载于1995年版《卫生部藏药标准》 第一册、国家药品监督管理局标准［WS-625（Z-170）-2002试行］［1］。方中菥蓂子、芒果核、蒲桃、大托叶云实清热补肾，干簧水，可治疗膀胱炎症、肾热［2-5］；紫草茸、茜草、山矾叶、圆柏枝清热消炎，可治疗肾炎扩散热症、腰肌酸痛、疗毒症［6-8］；豆蔻、刀豆温肾壮阳，可治疗寒、热性肾虚［9-10］；诃子、波棱瓜子、巴夏嘎清血，可治疗胆热症［11-14］，全方功效清热解毒、消炎止痛、通淋，可用于膀胱炎症、淋病、肾扩散热症及浮肿、水肿、寒热引起的阴囊肿胀等疾病。

目前，十三味菥蓂丸在全国共有9个批准文号，但其现行检验标准只有性状、重量差异、水分，以及茜草、紫草茸主要成分的TLC 定性鉴别，缺乏组方药材质控指标及定量标准，难以全面保证产品质量稳定性和用药安全性，而且该标准已经数十年未作修改。另外，对中药品种的研究大多从含有量控制角度出发，较少考虑到药品常规显微鉴别和薄层鉴别［15-18］。

本实验从菥蓂子、茜草、豆蔻、山矾叶、紫草茸显微鉴别，茜草、菥蓂子、刺柏TLC 定性鉴别，以及成分、重金属含有量测定等方面出发，对十三味菥蓂丸展开了较系统的研究，以期能为该制剂质量标准的提升提供参考，也可更好地推动其质量评价与监管工作。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪（配置DAD 检测器）、Agilent 7700ICP-MS 仪（美国Agilent 公司）；XP205、XP504电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MDS-2002A 微波消解仪（北京合悦达科技有限公司）；SBX51显微镜（日本奥林巴斯公司）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂分厂）。

1.2 试药 茜草（编号XZBBG-1-9）、刺柏（编号XZBBG-2-11）对照药材，来自西藏自治区食品药品检验研究标本室；菥蓂子（批号121599-201202）对照药材，购自中国食品药品检定研究院。黑芥子苷对照品（批号X1450010），购自上海安谱实验科技股份有限公司，含有量高于98.5%。十三味菥蓂丸由5家生产企业提供，A 厂家提供 13个批号（CY20160136、CY20160137、CY20160138、CY20160183、CY20160184、CY20160185、CY20160209、CY20160218、CY20160261、CY20160293、CY20160309、CY20160315、CY20160310，编号1～13），B厂家提供 8个批号（CY20160150、CY20160186、CY20160187、CY20160212、CY20160213、CY20160262、CY20160314、CY20160322，编号14～21），C 厂家提供3个批号（CY20160199、CY20160303、CY20160316，编号22～24），D 厂家提供1个批号（CY20160143，编号25），E 厂家提供1个批号（CY20160307，编号26）。铅［编号-批号GBW（E）080129-15101，标准值100 μg／mL］、镉（编号-批号GBW08612-15062，标准值1 000 μg／mL）、砷［编号-批号GBW（E）080117-15102，标准值100 μg／mL］、汞（编号-批号GBW08617-15096，标准值1 000 μg／mL）、铜（编号-批号GBW08615-15111，标准值1 000 μg／mL），均购自中国计量科学研究院。乙腈为色谱纯（美国Fisher Scientific 公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水（美国Millipore 公司）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 本品粉末呈红棕色，种皮细胞为棕色薄壁细胞，表面观类多角形，单个散在类圆形（菥蓂子）；胚乳细胞呈多角形，充满细小的淀粉粒，集成团，包埋细小偶见的草酸钙方晶、深浅不一红棕色色素、石细胞类圆形或多角形（豆蔻）；草酸钙针晶束20～70 μm；偏光下呈红白间多色彩（茜草）、草酸钙簇晶单个或多个（山矾叶）；偶见腺毛长30～75 μm（紫草茸）。见图1。

图1 十三味菥蓂丸显微特征

表1显示，菥蓂子、豆蔻、茜草、山矾叶、紫草茸显微特征在5家生产企业样品中均能见到，表明其准确可靠，重复性好。

表1 5家生产企业样品显微鉴别结果

2.2 TLC 定性鉴别

2.2.1 茜草 取本品6 g，研细，加30 mL 甲醇超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加20 mL 水溶解，再加1 mL稀盐酸，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸干，1 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液；取对照药材0.5 g，同法制成相应溶液。按照2015年版《中国药典》 四部薄层色谱法0502，吸取上述2种溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲苯-丙酮-甲酸（5 ∶5 ∶0.8 ∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图2。由图可知，样品色谱在对照药材相应位置上显相同颜色荧光斑点，分离度较好，阴性无干扰。

图2 茜草TLC 色谱图

2.2.2 菥蓂子 取本品4 g，研细，加20 mL 石油醚（30～60 ℃），过滤，残渣加70%乙醇加热回流30 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液；取对照药材0.5 g，同法制成相应溶液。按照2015年版《中国药典》四部薄层色谱法0502，吸取上述2种溶液各3～5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水-乙酸（8 ∶1 ∶1 ∶1 ∶0.2）为展开剂，展开（展距12 cm），取出，晾干，喷以3%氯化铝乙醇溶液，105 ℃下加热后置于紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图3。由图可知，样品色谱在对照药材相应位置上显相同颜色荧光斑点，分离度较好，阴性无干扰。

图3 菥蓂子TLC 色谱图

2.2.3 刺柏 取本品4 g，研细，加70%甲醇25 mL、盐酸1 mL，加热水解1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL 溶解，乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加1 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液；另取对照药材1 g，同法制成相应溶液。按照2015年版《中国药典》四部薄层色谱法0502，吸取上述2种溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以（环己烷-三氯甲烷）-乙酸乙酯-冰醋酸（20 ∶5 ∶8 ∶0.1）为展开剂，展开（展距14 cm），取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃下加热至斑点显色清晰，置于紫外灯（365 nm）下检视，结果见图4。由图可知，样品色谱在对照药材相应位置上显相同颜色荧光斑点，分离度较好，阴性无干扰。

图4 刺柏TLC 色谱图

2.3 黑芥子苷含有量测定

2.3.1 溶液制备

2.3.1.1 对照品溶液 精密称取黑芥子苷对照品适量，加水溶解，制成每1 mL 含0.12 mg 该成分的溶液，即得。

2.3.1.2 供试品溶液 取装量差异项下的样品，研细，精密称取粉末约4 g，置于具塞锥形瓶中、精密加入40%乙醇50 mL，称定质量，回流提取45 min，放冷，40%乙醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.1.3 阴性样品溶液 按照处方比例制备缺菥蓂子的阴性样品，按“2.3.1.2”项下方法制备，即得。

2.3.2 色谱条件及专属性考察 Waters XSELECT CSH C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱温30 ℃；流动相乙腈-0.02 mol／L 四丁基硫酸氢铵（氨试液调pH=6）（15 ∶85）；体积流量1.0 mL／min；检测波长227 nm；进样量10 μL，色谱图见图5。由图可知，阴性样品在对照品色谱峰相应位置上无干扰峰出现，表明该方法专属性良好。

2.3.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液（0.668 5 mg／mL）2、4、8、12、20、30 μL，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，得方程为Y=19 200X＋415（r=0.999 7），在1.34～20.05 μg 范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 取同一对照品溶液10 μL，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定6次，测得黑芥子苷峰面积RSD 为0.3%，表明仪器精密度良好。

图5 黑芥子苷HPLC 色谱图

2.3.5 重复性试验 精密称取样品（5号）6份，按“2.3.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，测得黑芥子苷含有量RSD 为1.40%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一供试品（5号）溶液10 μL，室温下于0、2、4、8、10、12 h 在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，测得黑芥子苷峰面积RSD 为1.4%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.7 加样回收率试验 精密称取样品（5号）6份，加入等量对照品，按“2.3.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.3.8 样品含有量测定 取5家生产企业26批样品，按“2.3.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

表2 黑芥子苷加样回收率试验结果（n=6）

表3 黑芥子苷含有量测定结果

2.4 重金属含有量测定

2.4.1 供试品溶液制备 精密称取样品细粉0.25 g，置于聚四氟乙烯消解罐内，加硝酸5 mL 混匀，置于微波消解炉中，按操作规程安装完装置后按以下程序进行消解。

第1步：1 600 W 功率在3 min 内从室温加热至110 ℃，保持2 min。

第2步：1 600 W 功率在2 min 内从110 ℃加热至150 ℃，保持3 min。

第3步：1 600 W 功率在3 min 内从150 ℃加热至185 ℃，保持9 min。

消解结束后，冷却至罐内温度低于70 ℃，缓缓放气，取出内罐置于加热板上，110 ℃下加热以使NO2蒸气挥尽，并持续浓缩至2～3 mL，放冷，加水稀释至50 mL，摇匀，即得。同法制备试样空白溶液。

2.4.2 标准液制备 精密量取Pb、Cd、As、Hg、Cu 标准贮备液适量，2%硝酸制成每1 mL 分别含Pb 2、4、8、10、16、20 ng，Cd 0.2、0.5、1、2、4、5 ng，As 2、4、8、10、16、20 ng，Hg 0.2、0.5、1、2、4、5 ng，Cu 25、50、100、150、200、250 ng，即得。

2.4.3 样品含有量测定 按2015年版《中国药典》 四部铅、镉、砷、汞、铜测定法（2321）测定，结果见表4。

3 讨论

3.1 显微鉴别 结合十三味菥蓂丸工艺流程，个别药味经过提取加工后无法鉴别显微特征，在显微镜下只有淀粉粒、导管特征。本实验发现，菥蓂子、豆蔻、茜草、山矾叶、紫草茸显微特征在各生产企业样品中均能见到，表明可将其作为该制剂显微特征。

表4 重金属含有量测定结果

3.2 TLC 定性鉴别 课题组前期对5家生产企业进行实地考察后发现，有些厂家对原药材入库检验不够完善，而且依据标准没有统一规范，许多原药材辨认仅靠主观经验。菥蓂子、刺柏是十三味菥蓂丸中特色药味，而且前者有效成分黑芥子苷含有量较高，是主要药效成分，故本实验对两者进行TLC 定性鉴别。结果显示，各生产企业样品TLC色谱图分离度良好，斑点颜色清晰，阴性无干扰。

3.3 成分含有量限度 26批样品中黑芥子苷含有量范围在1.12～7.5 mg／g 之间，表明差异较大，结合十三味菥蓂丸工艺流程及相关研究数据，目标成分按照转移率80%计算，同时考虑到制剂存放时间、生产工艺稳定对黑芥子苷含有量的影响，暂订本品每1 g 含菥蓂子以黑芥子苷计应为4.5～7.5 mg／g，由此可知有8批不符合规定，占30.8%，其原因可能与原料药质量或生产工艺不稳定有关。另外，同一生产企业不同批次样品，以及不同生产企业样品中黑芥子苷含有量RSD 均在4% 以上，也印证了上述现象。

3.4 重金属含有量限度 虽然十三味菥蓂丸不含重金属，但本实验发现As、Hg、Cu 超出规定值，而且差异较大，无明显规律差异，可能是原材料引入的污染，也有可能是生产过程中的污染，难以作出统一的限量规定。WHO 规定，重金属暂定每周耐受摄入量分别为Pb 0.025 mg／kg、Cd 0.007 mg／kg、As 0.015 mg／kg、Hg 0.001 6 mg／kg，即最大日摄入量（暂定每周耐受摄入量×60／7×1 000）分别为Pb 214 μg、Cd 60 μg、As 128 μg、Hg 14 μg，而本实验测定结果（表4）远低于该规定，即服用十三味菥蓂丸不会造成重金属高摄入。

4 结论

十三味菥蓂丸为藏族验方，方中用药遵循藏医药传统，但课题组前期调查发现部分生产企业用的药材有茜草、巴夏嘎（塞北紫堇）、婆婆纳、鸭嘴花，比较混乱，故应考以规范，明确药材来源，建立统一标准。同时，该制剂原标准检测项目过于简单，设置不完善，无法真实客观评价其质量状况，更无法有效进行质量控制；本实验从药品质量标准方面对其显微特征、TLC 定性鉴别、指标成分（黑芥子苷）及重金属含有量测定进行较为系统的研究，以期为相关质量标准提高和修订提供参考依据。