鳖甲煎丸含药血清对SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响

孙 阳，陶雪莲，解 颖，孙许涛，姜德友

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040）

原发性肝癌属于祖国医学中“癥瘕积聚”“肝积”“臌胀”“黄疸”等范畴。该病多为情志抑郁、气机不畅、气滞血瘀、血行受阻，日积月累而成积聚。另外，邪毒外侵、湿热郁蒸或嗜酒过度，热毒内蕴等因素也认为是诱因［1］。鳖甲煎丸是张仲景所创，由鳖甲、柴胡、厚朴等二十三味药组成，具有软坚散结、祛湿化痰、活血化瘀等功效［2-3］。前期在体实验发现，鳖甲煎丸对H22鼠肝癌细胞具有抑制作用，电镜观察发现细胞发生凋亡，细胞中抗凋亡因子Survivin 和STAT3蛋白表达下调［4］。本实验在前期实验的基础上，研究鳖甲煎丸含药血清对人肝癌SMMC-7721细胞的影响，进而探讨鳖甲煎丸治疗肝癌的可能机制。

1 材料

1.1 细胞株、动物 SMMC-7721肝癌细胞购于博士德生物公司（编号CX0296）；Wister 大鼠，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证书SCXK（黑）2013-012，在常温实验设施环境中给予无菌饲料和蒸馏水饲养。

1.2 试药 鳖甲煎丸（国药集团中联药业有限公司，国药准字Z42020772，批号150870）；顺铂（美国Sigma 公司，批号MKBV3446V）；MTT（美国Sigma 公司，批号M-2128）；AnnexinⅤ-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（碧云天公司，批 号 C1062）；Bcl-2、BAX、STAT3、p-STAT3和GAPDH 一 抗（Abcam 公 司，批号分别为 ab182858、ab32503、ab68153、ab76315和ab128915）。

1.3 仪器 Aira 流式细胞仪（美国BD 公司）、Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo 公司）、MX3000P 实时荧光PCR仪（美国安捷伦科技公司）、DPX-9162B-1电热恒温培养箱（上海福玛）、PowerPacTMHC 型电泳仪（美国Agilent 公司）、VE-180型垂直电泳槽（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 制备鳖甲煎丸含药血清 参考鳖甲煎丸临床用量，根据转换公式计算大鼠的剂量，将人日用剂量的15倍鳖甲煎丸用生理盐水配置成悬溶液。大鼠适应性饲养7 d 后，正常对照组给予生理盐水；鳖甲煎丸组每日给予12 g／kg 鳖甲煎丸悬溶液，分2次给药，连续灌胃3 d，第3天第1次给药后2 h 再次给药，1 h 后乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血［5］，静置2 h 以上，1 500 r／ min 离心15 min，收集血清，将其混合，56 ℃，30 min 灭活，分装，-20 ℃冰箱保存备用。

2.2 MTT 法检测肝癌细胞增殖 将SMMC-7721细胞消化成单细胞悬液接种于96孔板上（密度1×104／mL，每孔200 μL），空白对照组加入完全培养液（正常组血清10%，鳖甲煎丸血清0%），实验组分别加入鳖甲煎丸不同浓度含药血清（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%），在37 ℃，5% CO2，湿度适宜条件下分别作用24、48 h，将每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h 后弃上清，每孔加入100 μL 二甲基亚砜DMSO，振荡摇匀。波长490 nm，酶标仪读取吸光度（A）。计算细胞增殖抑制率=（1-A实验组平均值／A对照组平均值）×100%，每组设定5个重复孔，计算平均值。根据实验结果，设定后期实验鳖甲煎丸高、中、低剂量组。

2.3 流式细胞术检测肝癌细胞凋亡 将密度为5×104／mL SMMC-7721细胞接种于6孔板中。细胞贴壁生长后，将培养液吸弃，加入鳖甲煎丸低、中、高剂量（5%、10%、15%）含药血清和阳性对照药顺铂（顺铂加入完全培养液，10 μg／mL 顺铂）作用细胞24 h，PBS 缓冲液冲洗，胰酶消化后收集细胞并计数。取50 000重悬的细胞，1 000 g／min离心5 min，弃上清，加入195 μL AnnexinV-FITC 结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀。加入10 μL PI，轻轻混匀。室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测荧光强度，应用FACSDiva Version6.1软件对凋亡率进行分析。结果见图1。

2.4 qRT-PCR 法检测肝癌细胞Bcl-2、BAX、STAT3 mRNA表达 收集各组细胞，细胞总RNA 用Trizol 法提取，琼脂糖凝胶电泳法分析RNA 的完整度，分光光度计测定RNA的浓度和纯度。在无菌离心管中配置反应体系，逆转录实验方法及条件同文献［6］。依据Genbank 数据库，查找BAX、Bcl-2、STAT3、GAPDHmRNA 的全基因序列，引物由上海艾博思生物科技有限公司协助合成。引物序列为GAPDH（113 bp）正向5’ -CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，反 向 5’ -AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；Bcl-2（89 bp）正向5’ -CCCTGTGGATGACTGAGTACCTG-3’，反向5’ -GCCGTACAGTTCCACAAAGGC-3’；BAX（150 bp）正向 5 ’ -CCCTTTTCTACTTTGCCAGCA-3 ’，反 向 5 ’ -GGAGTCTCACCCAACCACCC-3’；STAT3（148 bp）正 向5’ -CAGCAGCTTGACACACGGTA-3’，反 向 5’ -ACACCAAAGTGGCATGTGA-3’。反应条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃，30 s，62 ℃，40 s，循环40次。每组3个复孔，采用2-ΔΔCt计算目的基因mRNA 相对水平。

2.5 Western blot 法检测肝癌细胞Bcl-2、BAX、STAT3、p-STAT3蛋白表达 收集经5%、10%、15%鳖甲煎丸含药血清和顺铂（10 μg／mL）作用24 h 的SMMC-7721细胞，PBS洗涤后加入蛋白裂解液作用1 h，收集上清，测定各组蛋白浓度。取蛋白20 μg 加入上样缓冲液，95 ℃条件下变性10 min。经过凝胶电泳、转膜、封闭，加入稀释的一抗（Bcl-2、BAX、STAT3、p-STAT3，1 ∶1 000；GAPDH 1 ∶10 000），4 ℃孵育过夜，漂洗后加入标记后的二抗（1 ∶5 000）孵育后显影检测，应用Gel-Pro Analyzer 软件分析。

2.6 统计学分析 应用SPSS 19.0软件分析实验数据。计量资料以（）表示，组间比较采用方差分析或独立样本t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞增殖的影响 如表1所示，随着鳖甲煎丸含药血清浓度增加，细胞增殖抑制率增加，呈浓度依赖性。根据实验结果，后续实验选用5%、10%、15%鳖甲煎丸含药血清。

表1 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞增殖的影响（， n=6）

表1 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞增殖的影响（， n=6）

注：与空白对照组比较：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

3.2 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞凋亡率的影响 如表2所示，鳖甲煎丸含药血清作用肝癌细胞24 h 后，早期凋亡率、晚期凋亡率均明显高于空白对照组，总凋亡率显著升高（P＜0.01），并具有浓度依赖 性。阳性对照组（10 μg／mL顺铂）细胞早期凋亡、晚期凋亡率均高于鳖甲煎丸组，且总凋亡率最高（P＜0.01）。

表2 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞凋亡率的影响（%，， n=3）

表2 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞凋亡率的影响（%，， n=3）

注：与空白对照组比较，＃＃P＜0.01；与阳性对照组比较，∗∗P＜0.01

图1 鳖甲煎丸对肝癌细胞凋亡的影响

3.3 鳖甲煎丸 对SMMC-7721细胞Bcl-2、BAX、STAT3 mRNA 表达的影响 如表3所示，药物作用SMMC-7721细胞24 h 后，与空白对照组比较，除5%含药血清鳖甲煎丸组Bcl-2、BAXmRNA 外，鳖甲煎丸组、阳性对照组能显著抑制Bcl-2、STATS3 mRNA 表达（P＜0.05，P＜0.01），促进BAXmRNA 表达（P＜0.05，P＜0.01）。阳性对照组Bcl-2 mRNA 表达显著低于鳖甲煎丸组（P＜0.01），但STAT3 mRNA 表达明显高于鳖甲煎丸组（10%、15% 含药血清）（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞Bcl-2、 BAX、 STAT3 mRNA 表达的影响（， n=3）

表3 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞Bcl-2、 BAX、 STAT3 mRNA 表达的影响（， n=3）

注：与空白对照组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与阳性对照组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

3.4 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞BAX、Bcl-2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响 如图2所示，药物作用SMMC-7721细胞24 h 后，与空白对照组比较，鳖甲煎丸组、阳性对照组能显著抑制Bcl-2、STAT3、p-STAT3蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01），BAX／Bcl-2比值显著升高（P＜0.01）。

图2 鳖甲煎丸对SMMC-7721细胞Bcl-2、BAX、STAT3和p-STAT3蛋白的影响（n=3）

4 讨论

天然药物抗肿瘤的机制主要有抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，降低放化疗的副作用及逆转肿瘤多药耐药等［7-10］。鳖甲煎丸是临床经验方剂，有广泛的开发前景，尤其在抗肿瘤方面的研究具有重要意义。有学者研究发现，鳖甲煎丸对肝星状细胞、HepG2、H22肝癌细胞均有抑制作用［11-14］，但对SMMC-7721肝癌细胞的研究鲜见报道。本实验发现，鳖甲煎丸含药血清诱导了SMMC-7721肝癌细胞凋亡，抑制Bcl-2 mRNA 表达，上调BAXmRNA 表达，BAX 蛋白表达上调虽不显著，但鳖甲煎丸明显增加了BAX／Bcl-2，具有浓度依赖性。Bcl-2和BAX 都是Bcl-2家族成员。Bcl-2家族是作用于线粒体的细胞凋亡关键调节分子。Bcl-2抑制凋亡［15］，BAX 促进凋亡［16］，它们调节膜通道的开放和促凋亡物质的流动，这是凋亡信号转导的关键。通过本实验推测，鳖甲煎丸诱导SMMC-7721细胞凋亡的机制可能是激活了线粒体凋亡途径。Bcl-2上游基因有STAT3基因［17-18］，JAK／STAT 信号通路参与细胞增殖、凋亡及免疫调节［19-20］。在炎症相关的肝癌细胞中，转录因子STAT3高度活化，p-STAT3可与下游核内特异的DNA 结合，直接或间接地上调抑制凋亡基因的表达，进而调控细胞增殖及凋亡［21-23］。鳖甲煎丸含药血清抑制了SMMC-7721细胞STAT3基因表达，其下游基因Bcl-2表达也同时下调，可能药物抑制了JAK／STAT 信号通路，发挥诱导SMMC-7721细胞线粒体途径凋亡。本课题组前期在体实验也发现，鳖甲煎丸通过抑制STAT 信号通路诱导H22肝癌细胞凋亡［4］。今后我们将继续研究鳖甲煎丸抗肿瘤的其他可能机制。