虎杖醇提物对阿尔茨海默病模型小鼠的影响

张二飞，殷 紫，齐 越，钱 俊，张朝晨

（1.江苏食品药品职业技术学院制药工程学院，江苏 淮安223003；2.江苏护理职业学院检验药学系，江苏 淮安223001；3.辽宁中医药大学附属第二医院辽宁 沈阳110034；4.淮安市妇幼保健院药剂科，江苏淮安223001）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病，主要病理特征为脑内的不同脑区，特别是海马区内β-淀粉样蛋白（Aβ）的过量产生和聚集。Aβ 是淀粉样蛋白前体蛋白（APP）在β-和γ-分泌酶作用下衍生而成［1］，具有神经毒性作用［2］。以往的研究发现，Aβ 与学习记忆密切相关［3］，大鼠海马和脑室内微量注射Aβ，可导致学习和记忆缺陷［4-5］，同时伴随着脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表达的减少。

虎杖为多年生草本植物虎杖Polygouum cuspidutumSieb.et Zucc 的干燥根茎和根，前期研究表明，虎杖醇提物具有改善AD 模型小鼠学习记忆能力，抑制tau 蛋白磷酸化的作用［5］，但对于是否具有降低Aβ 的作用尚不明确。因此本研究以Aβ25-35侧脑室注射诱导AD 小鼠模型，观察虎杖醇提物对Aβ 含有量的影响及其相关机制，旨在为药物治疗AD 提供更为优选的药物。

1 材料

1.1 动物 选取8周龄，体质量（20±2）g，SPF 级ICR小鼠78只，雄性，辽宁长生生物技术有限公司提供，生产许可证号SCXK（辽）：2010-0001，动物购买后，饲养于辽宁省中医药研究院实验动物中心，使用许可证号SYXK（辽）：2010-0003。

1.2 试药 虎杖中药饮片购于辽宁中医药大学附属第二医院的中药局，经药学室姜鸿研究员鉴定为虎杖中药材。虎杖醇提物提取过程如下，虎杖干燥的根，切成小段，取495 g，加入8倍量70%的乙醇，于90 ℃加热回流提取2 h，过滤，药渣再次加入6倍量70%的乙醇，90 ℃加热回流提取2 h，共2次，3次滤液合并后，85 ℃减压浓缩后，获得浸膏91.47 g，每1 g 浸膏相当生药5.41 g。盐酸多奈哌齐片［卫材（中国）药业有限公司提供，批号131219A，规格5 mg／片］；Aβ25-35（美国Sigma 公司，货号A4559）；小鼠Aβ1-40试剂盒（美国invitrogen 公司，货号KMB3441），小鼠Aβ1-42试剂盒（美国invitrogen 公司，货号KMB3481）；脑源性神经营养因子（BDNF）（英国Abcam 公司，货号ab108319）；5’单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK，英国Abcam 公司，货号ab32112）；磷酸化5’单磷酸腺苷活化蛋白激酶（p-AMPK，英国Abcam 公司，货号ab133448）；过氧化物酶体增值物激活受体（PGC-1α，英国Abcam 公司，货号ab54481）；酪氨酸激酶B（TRKB，北京博奥森科技有限公司，货号bs-0288R）；磷酸化酪氨酸激酶B（p-TRKB，北京博奥森科技有限公司，货号bs-5526R）；β-激动蛋白（β-actin，北京博奥森科技有限公司，货号bs-0061R）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H ＋L，英国Abcam 公司，货号ab6721）。

1.3 仪器 DW-200型脑立体定位仪（成都泰盟科技公司）；Western blot 电泳仪（美国BIO-RAD 公司），Azure AO 型酶标仪（美国Azure 公司）。

2 方法

2.1 造模及给药 小鼠在实验动物中心适应性饲养并观察1周后，按体重随机分为假手术组、模型组、多奈哌齐（1.3 mg／kg）及虎杖醇提物低、中、高剂量组（2、6、18 g／kg生药）分笼饲养，每组13只，自由进食，饮水。Aβ25-35在进行侧脑室注射前，要将其老化，具体过程如下，将Aβ25-35溶解于无菌的生理盐水中，置于37 °C 培养箱中，连续孵育120 h 后，取出，准备进行侧脑室注射。各组小鼠腹腔注射350 mg／kg 水合氯醛，麻醉后，固定于脑立体定位仪上，剔除头部毛发，碘酒、酒精消毒。沿颅骨中线用手术刀切开头部皮肤，长度约2 cm，暴露囟门，以囟门为零点，旁开1.0 mm，向后0.5 mm，深度3.0 mm，在2 min内将3 μL 老化的Aβ25-35缓慢注射入侧脑室内，留针5 min，缓慢将针拔出。手术后的小鼠放入鼠笼饲养（注意保暖）。假手术组小鼠注入等体积的生理盐水。造模后第2天，各组小鼠按20 mL／kg 给药容积灌胃给药，1次／d，连续灌胃21 d。用0.5% 羧甲基纤维素钠（0.5% CMC -Na）将虎杖醇提物溶解到相应的浓度，即2、6、18 g／kg 生药，假手术组和模型组给予相应体积的0.5% CMC -Na。

2.2 检测Morris 水迷宫行为学 各组小鼠于第16天给药结束1 h 后进行Morris 水迷宫定位航行实验。Morris 水迷宫的装置为白色铁质圆桶，高33 cm，底面直径为80 cm，顶部开口。将水迷宫底面分别标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限，平台放置于Ⅰ象限处，低于水平面1 cm。保持圆桶内水温为25 ℃左右。实验进行时，要记录各组小鼠从入水处到可发现平台并能成功登录平台的距离，即为总路程。若不能成功登陆平台，要训练能够找到，并在平台上保持10 s。每天每只小鼠训练游泳2次，间隔时间为4 h，连续进行5 d。

2.3 ELISA 测定小鼠海马内可溶性及难溶性Aβ 水平21 d 给药后1 h，每组取8只小鼠，冰上取出海马组织，置于离心管中，加入含有蛋白酶抑制剂的组织裂解液，冰上匀浆10 s，间歇30 s 后，再次匀浆10 s，重复5次；4 ℃、20 000 r／min 离心5 min，收集上清，用作检测可溶性待测物质；在离心沉淀物中加入70% 甲酸，冰上匀浆；4 ℃，44 000 r／min 离心5 min，以1 mol／L Tris 中和上清，分装，用作检测非可溶性待测成分。按照ELISA 试剂盒说明书的操作步骤进行测定。

2.4 Western blot 测定小鼠海马AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表达 21 d 给药后1 h，每组取5只小鼠，断头处死后，分离海马，称定质量。加入蛋白裂解液，提取总蛋白，BSA 法测定组织中的蛋白浓度。采用12%的凝胶进行电泳，100 mA，2 h 进行转膜，5%脱脂牛奶，室温封闭2 h，加入相应浓度的一抗，于4 ℃处孵育静置过夜。TBST洗涤3次，10 min／次，进行二抗孵育，TBST 再次洗涤3次，10 min／次，加入特超敏ECL 化学发光液，凝胶成像系统观察相关蛋白的表达。采用Image J 图像分析软件对WB条带进行灰度分析，得到灰度值后，将模型组灰度值设定为1，其余各组按照对应的比率得到相应的灰度值，组间比较，进行相关数据分析。

2.5 统计学分析 用SPSS 17.0统计进行分析，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 虎杖醇提物对阿尔茨海默病小鼠Morris 水迷宫的影响各组小鼠由于要在前3天摸索和适应水中环境，所以游泳总路程无明显差异。随着训练天数的延长，第4天及第5天时，与假手术组相比较，模型组小鼠游泳总路程明显延长（P＜0.05）；与模型组相比较，虎杖醇提物高、中剂量组以及盐酸多奈哌齐组可明显缩短游泳总路程（P＜0.05）。见图1。

图1 虎杖醇提物对阿尔茨海默病小鼠游泳总路程的影响

3.2 虎杖醇提物对阿尔茨海默病小鼠Aβ1-40、Aβ1-42水平的影响 与假手术组比较，模型组可溶性Aβ1-42、Aβ1-40与难溶性Aβ1-42、Aβ1-40水平显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，虎杖醇提物可显著降低可溶性与难溶性Aβ1-42、Aβ1-40水平（P＜0.05）说明虎杖醇提物具有降低Aβ 水平的作用。见表1。

表1 虎杖醇提物对阿尔茨海默病小鼠Aβ1-40、Aβ1-42水平的影响（pg／mg，， n=8）

表1 虎杖醇提物对阿尔茨海默病小鼠Aβ1-40、Aβ1-42水平的影响（pg／mg，， n=8）

注：与假手术组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，∗P＜0.05

3.3 虎杖醇提取物对阿尔茨海默病小鼠海马AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表达影响 与假手术组比较，模型组p-AMPK、BDNF、p-TRKB 及PGC-1α 蛋白表达均减少（P＜0.05）；与模型组比较，虎杖醇提物高剂量组明显增加p-AMPK、BDNF、p-TRKB 及PGC-1α 表达（P＜0.05）。见图2、表2。

4 讨论

图2 虎杖醇提取物对阿尔茨海默病小鼠海马AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表达影响

表2 虎杖醇提取物对阿尔茨海默病小鼠海马AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表达影响（， n=5）

表2 虎杖醇提取物对阿尔茨海默病小鼠海马AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表达影响（， n=5）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

阿尔茨海默病的主要病理特征包括tau 蛋白磷酸化、Aβ 沉积及神经元丢失。研究发现，Aβ 产生增多或清除减少可导致Aβ 的异常聚集，进而导致神经元损伤，加重阿尔茨海默病的认知功能障碍。最近的研究发现，采用PET对阿尔茨海默病患者脑部进行检查，发现阿尔茨海默病患者脑内存在大量的Aβ 沉淀［6］。因此，抑制Aβ 的集聚可改善阿尔茨海默病的学习记忆功能。本研究结果表明，与模型组相比，虎杖醇提物可减少可溶性及难溶性Aβ 的含有量，说明虎杖醇提物具有抑制Aβ 聚集的作用。

BDNF 是神经营养因子家族的重要成员，存在于海马、皮质，杏仁核和小脑中，含有量丰富，具有调控神经细胞生长、分化及突触可塑性的作用，并可能参与了阿尔茨海默病的病理过程［7］。BDNF 与海马的学习和记忆过程有关，具有学习记忆障碍的阿尔茨海默病患者及阿尔茨海默病模型小鼠BDNF 水平降低。Aβ 可通过干扰其轴突运输影响突触处的BDNF 水平［8］。研究发现，BDNF 通过与高亲和力受体酪氨酸激酶（TrkB）结合后，促使酪氨酸激酶发生磷酸化，活化后的受体触发胞内信号转导，进一步提高了突触联系，从而增强其学习记忆能力。本研究结果表明，虎杖醇提物可增加阿尔茨海默病模型小鼠脑内的磷酸化酪氨酸激酶水平，提高BDNF 的表达。

PGC-1α 为调节线粒体功能的关键因子，在脑内发挥着重要的作用。PGC-1α 的缺乏，可导致神经元的结构异常和丢失，抗氧化防御系统损伤等［9］。阿尔茨海默病患者脑内PGC-1α 水平明显降低。最近的研究显示，PGC-1α 表达的增加，可改善阿尔茨海默病患者的认知功能障碍［10］。本研究结果表明，虎杖醇提物可增加PGC-1α 的表达。此外，Aβ 可通过PGC-1α 途径抑制BDNF 的表达。由此进一步说明，虎杖醇提物可能是通过增加PGC-1α 表达，提高磷酸化酪氨酸激酶和BDNF 水平，进而抑制Aβ 聚集。

AMP 激活蛋白激酶（AMPK）作为调节PGC-1α 的代谢反应元素之一，在减少Aβ 生成中起着重要的作用［9］。AMPK 的活性主要受细胞内的AMP／ATP 比值进行调节。生理状况下，细胞内保持着高浓度的ATP 水平，用以维持基本的细胞代谢需求，此时，AMPK 主要以无活性的状态存在，AMP／ATP 比值降低［10］。阿尔茨海默病脑内AMPK活性下降时，伴随着PGC-1α 及BDNF 表达下调［11-12］。激活AMPK 可改善阿尔茨海默病脑内的能量代谢紊乱［13］，增加PGC-1α 及BDNF 表达，抑制Aβ 的生成。本研究结果表明，虎杖醇提物可提高p-AMPK／AMPK 比率，促使BDNF及PGC-1α 表达增加。

综上所述，虎杖醇提物改善阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力，可能是通过增加AMPK 的活性，改善了脑内的能量代谢紊乱，促使PGC-1α 及BDNF 表达增加，从而降低了脑内Aβ 的集聚。研究发现，Aβ 还可促使tau 蛋白异常磷酸化［14-15］。结合前期研究，虎杖醇提物具有抑制tau 蛋白异常磷酸化的作用，可推测，虎杖醇提物可能是通过AMPK／PGC-1α／BDNF／TRKB 信号通路，降低Aβ 的产生，进而抑制tau 蛋白的过度磷酸化，从而改善了阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆障碍。

虽然实验已经证明虎杖醇提物可通过调控AMPK 活性增加，促使PGC-1α 及BDNF 表达上调，改善学习记忆功能，但影响PGC-1α 表达的其他因素，如c-AMP 反应元件结合蛋白（CREB）及酵母沉默信息调节子（SIRT），仍有必要在未来的实验中进行进一步的研究，以便更为详实的探讨虎杖醇提物抗阿尔茨海默病的作用机制。