五味子油低共熔溶剂萃取抗氧化物的研究

鲍英杰，王 磊，饶桂维*

(1.浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015;2.杭州师范大学 钱江学院理工分院，浙江 杭州 310018)

五味子分为北五味子和南五味子，北五味子质一般比南五味子优良。北五味子呈不规则的球形或扁球形，直径5～8 mm。表面红色、紫红色或暗红色，皱缩，显油润，果肉柔软，有的表面呈黑红色或出现“白霜”。肾形，表面棕黄色，有光泽，种皮薄而脆。果肉气微，味酸；种子破碎后，有香气，味辛、微苦。北五味子主要产地为东北地区及内蒙古、河北、山西等地。南五味子粒较小。表面棕红色至暗棕色，干瘪，皱缩，果肉常紧贴种子上[1]。五味子中含有五味子素及维生素C、树脂、鞣质及少量糖类。有敛肺止咳、滋补涩精、止泻止汗之效。五味子中含有木脂素、多糖、皂苷和黄酮等多种成分[2-3]，并且具有很好的抗氧化作用。其叶、果实可提取芳香油。种仁含有脂肪油，榨油可作工业原料、润滑油。茎皮纤维柔韧，可供绳索。低共熔溶剂是指由一定化学计量比的氢键受体体(如季铵盐)和氢键供体(如羧酸、醇、胺类和糖类等)组合而成低共熔混合物，其凝固点显著低于各个组分纯物质的熔点[4]。其制备简单，成本低,无需复杂的纯化,已经广泛应用于电化学、有机反应和功能材料等领域。低共熔溶剂作为萃取剂广泛结合各种萃取技术(超声辅助萃取、微波辅助萃取、中空纤维萃取和固相萃取等)。在萃取中低共熔溶剂的优势主要依赖于以下四个方面：(1)凝固点与其组分组成和物质的量比相关，(2)室温下具有较高黏度，(3)一般密度比水大，能快速沉降实现两项分离，(4)不同组分合成的低共熔溶剂具有不同极性，从而提高了对不同极性分析物的萃取效率。并且与传统的甲醇萃取剂相比,低共熔溶剂具有原料易得、低毒性、可生物降解、对环境无污染、容易再生等优点。这些特性决定了低共熔溶剂在中药的有效成分萃取方面有着较高的研究价值。随着低共熔试剂的不断开发，有越来越多的研究利用低共熔溶剂分离生物体中的活性成分，包括类黄酮、儿茶素、酚酸、萜类化合物和皂苷。

本文主要以干制北五味子为研究对象，提取其油脂，探究不同种低共熔溶剂作为萃取剂与传统甲醇萃取后产物的抗氧化性。从而得知各种低共熔溶剂与传统甲醇萃取五味子油有效成分的能力对比并选出最优组。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：五味子(干制)，产地为中国辽宁，研磨机研磨成粉状，放置在阴凉干燥处待用。

试剂：氯化胆碱，乙二醇，乳酸，柠檬酸，尿素，葡萄糖，草酸，甲醇，乙醇，硫酸亚铁，水杨酸，氢氧化钠，磷酸，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，邻苯三酚，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，盐酸。以上皆为分析纯。以及30%浓度过氧化氢。

设备：L6S紫外分光光度计，98-1-B型电子调温电热套，07HWS-2数显恒温磁力搅拌器，DF-101S集热式恒温磁力搅拌器，JK-100型超声波清洗器，KQ5200DE型超声波清洗机，C型30玻璃仪器快速烘干器，GL-20-G-Ⅱ型离心机，LG10-2.4A型离心机，RE-3000型旋转蒸发器,PL402-L型电子秤，ME204E型电子天平。

1.2 实验方法

1.2.1 五味子油的提取

精确称取20.00 g五味子粉末，放入圆底烧瓶中，以石油醚为提取溶剂，按照固液比1∶20(g∶mL)加入，保鲜膜封住瓶口避免石油醚挥发，在阴暗避光的环境下浸泡1 h。70 Hz超声10 min。再加热套加热至微沸，回流，对五味子粉末提取3 h[5-7]。3 h后停止加热，使石油醚缓慢降至室温，再用布氏漏斗过滤，在过滤之前，保证布氏漏斗已清洗干净，并要干燥完全，防止过滤时有水份混入，在下一步分离五味子油时，如果混合液中有水存在，五味子油和水极易产生乳化现象。过滤完成后取其澄清液，利用旋转蒸发仪分离石油醚，得到淡黄色澄清油状物，为五味子油。

1.2.2 DES的制备

用不同的氢供体来制备DES。按照比例，取两组组分，加入圆底烧瓶中，水浴恒温磁力搅拌，温度保持在80℃，直至形成均匀稳定的无色透明液体[8-9]。DES的保质期较短，萃取五味子油的DES需当天配制。对于氢键受体的选择，采用市面上主流，最多被使用的氯化胆碱，而氢键供体的选择，依照在实验和以后工业生产中，原料的成本易得性和安全可控的原则，选取乙二醇、乳酸、柠檬酸、尿素、葡萄糖、草酸六种。第一步实验中各DES组分的物质的量比采用大多数实验和工业生产中的1∶2的比例。制备的DES成分配比及其名称缩写如表1所示。

表1 各实验组低共熔溶剂的构成

1.2.3 DES萃取五味子油抗氧化物质

将配好的DES于水浴锅中60℃加热，降低黏度。取5.0 mL离心管，加入1.0 mL五味子油，再加入2.0 mL相应的DES。充分振荡，超声10 min，然后在60℃的水浴锅中萃取1 h。萃取时，混合物每隔15 min取出振荡半分钟。一小时后将混合物在离心机中以5000 r/min的转速离心10 min。离心结束，用注射器针头扎破离心管，取出萃取物(下层相)[10]。

1.2.4 甲醇/水(80∶20)萃取五味子油萃取抗氧化物质

取5.0 mL离心管，加入1.0 mL五味子油，随后加入2.0 mL甲醇/水(80∶20)混合。充分振荡后，超声10 min，然后在60℃的水浴锅中萃取1 h。在萃取时，混合物每隔15 min振荡半分钟。1 h后将混合物在离心机中以5000 r/min的转速离心10 min。离心结束，用注射器取出萃取物(上层相)。

1.2.5 不同萃取剂萃取的物质抗氧化性研究

1.2.5.1 各萃取物的全波段扫描

准备十四只比色管,将DES-1至DES-6和甲醇/水(80∶20)总共七组萃取剂萃取五味子油所得的物质各1.0 mL加入比色管中,甲醇稀释至25.0 mL。再准备DES-1至DES-6与甲醇/水(80∶20)总共七组萃取剂1.0 mL直接加入比色管中,甲醇稀释至25.0 mL。以只加入萃取剂的组别为对照组，对其对应萃取物进行全波段扫描[11]。

1.2.5.2 各萃取物的过氧化氢清除率的测定

选择一种萃取剂所萃取的物质5.0 mL，平均分为五组，分别添加0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%过氧化氢溶液。过半小时体系反应稳定后，稀释200倍，通过全波段扫描确定242 nm处为萃取物的最大吸收波长，在此波长下测定其总共五组吸光度[12]。分别测定DES-1至DES-6与甲醇/水(80∶20)总共七组萃取剂所萃取的物质。

1.2.5.3 各萃取物羟基自由基的清除率

选择一组萃取物，在反应体系中依次加入9×10-3mol/L的FeSO4溶液1.0 mL，9×10-3mol/L的水杨酸-乙醇溶液1.0 mL，以及1.0 mL萃取液，最后加入6×10-3mL/L的H2O21.0 mL，启动反应，在37℃水浴环境中反应0.5 h。最后在510 nm波长下测定样品的吸光度。空白组以相同体积蒸馏水代替样品溶液，按下式计算样品对羟基自由基的清除率[13-15]，分别测定DES-1至DES-6与甲醇/水(80∶20)总共七组萃取剂所萃取的物质。

式中∶Ao，空白对照液的吸光度；Ax，加入萃取液后的吸光度；Axo，不加H2O2时萃取液的本底吸光度。

1.2.5.4 各萃取物总还原力的测定

选择一组萃取物，在试管中依次加入萃取液2.0 mL和0.2 mol/L，pH值= 6.6 磷酸缓冲液2.5 mL，1 %铁氰化钾2.5 mL，混匀，于50℃水浴反应20 min，取出，立即用冰水水浴冷却至室温，再加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液，混合均匀后在离心机3000 r/min的转速下离心10 min，在离心管中吸取5.0 mL上清液，加入4.0 mL去离子水，1.0 mL的1 mg/mL三氯化铁溶液，静置10 min。蒸馏水作空白，700 nm测量吸光度，平行3次，取平均值。相同浓度下，吸光度值越大，表示样品还原能力越强[16-18]。分别测定DES-1至DES-6与甲醇/水(80∶20)，总共七组萃取剂所萃取的物质。

1.2.5.5 各萃取物的DPPH清除率

取0.0039 g DPPH加入100.0 mL无水乙醇。选择一组1.0 mL萃取液加入4.0 mL DPPH(0.101 mmol/L)溶液中，摇匀避光静置30 min，以甲醇对分光光度计调零，于517 nm波长下测定吸光值，定为 Ao，每组样品平行测定3次[14,19-21]，分别测定DES-1至DES-6与甲醇/水(80∶20)总共七组萃取剂所萃取的物质。

式中：Ao为空白对照吸光值，A为样品吸光值

1.2.5.6 各萃取物的超氧阴离子清除率的测定

采用邻苯三酚自氧化法，取5.0 mL 50 mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液(pH值=8)，置于25℃水浴中保温20 min，加入2.0 mL萃取液，再加入1.0 mL 5mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀，25℃水浴中反应5 min，最后加入1.0 mL 10 mol/L盐酸终止反应，在320 nm处测定吸光度，对照组以超纯水代替邻苯三酚溶液，空白组以蒸馏水代替待测液[22]。

式中：A为样品组吸光度；Ao为对照组吸光度;Aox为空白组吸光度

1.2.5.7 通过DPPH法比较同种类萃取剂的不同组分比对萃取效果影响的测定

用上述同种DPPH清除率方法，测量DES-1和DES-7至DES-10总共五组萃取剂所萃取的物质[10]。

2 结果与分析

2.1 各萃取物的全波段扫描

通过图1七种不同萃取物的全波段扫描图可知，各图的峰值在240～243 nm之间，平均值242 nm，此波长即可作为过氧化氢清除率测定的波长。各组最大的吸收峰值顺序是乙二醇DES组最大，其次是甲醇组，草酸DES组，葡萄糖DES组，乳酸DES组，尿素DES组，柠檬酸DES组。乙二醇DES组萃取物最大的吸收峰值为2.723 Abs。

图1 提取液全波长扫描

Fig.1 extract full wavelength scanning

2.2 不同萃取物的过氧化氢清除率

图2 不同浓度过氧化氢对各萃取物溶液的影响

由图2所示，随着过氧化氢浓度的提高，各萃取物溶液的吸光度变化不明显，说明其对于过氧化物的抗氧化性较好，并不能判断各个萃取剂萃取能力的区别。

2.3 不同萃取物的羟基自由基清除率

图3 不同萃取物的羟基自由基清除率比较

由图3所示，各萃取物的羟基自由基清除率的能力中以乙二醇DES为萃取剂的萃取物最佳，高于以传统甲醇/水(80∶20)为萃取剂，其余的DES萃取剂组均低于传统甲醇/水(80∶20)萃取剂组。

2.4 不同萃取物的总还原力测定

图4 不同萃取物的总还原力的比较

由图4所示，各萃取物的总还原力中以乙二醇DES为萃取剂的萃取物最佳，高于以传统甲醇/水(80∶20)为萃取剂，其余的DES萃取剂组均低于传统甲醇/水(80∶20)萃取剂组。

2.5 不同萃取物的DPPH清除率

图5 不同萃取物的DPPH清除率的比较

由图5所示，各萃取物的DPPH清除率中以乙二醇DES为萃取剂的萃取物最佳，其次是乳酸DES组的萃取物，高于以传统甲醇/水(80∶20)为萃取剂，其余的DES萃取剂组均低于传统甲醇/水(80∶20)萃取剂组。

2.6 不同萃取物的超氧阴离子清除率测定

图6 不同萃取物的超氧阴离子清除率的比较响

由图6所示，各萃取物的超氧阴离子清除率以乙二醇DES为萃取剂的萃取物最佳，其次是乳酸DES组的萃取物，高于以传统甲醇/水(80∶20)为萃取剂，其余的DES萃取剂组均低于传统甲醇/水(80∶20)萃取剂组。

2.7 DPPH法比较同种类萃取剂的不同组分比对萃取效果影响

图7 同种类萃取剂的不同组分比DPPH清除率比较

由图7所示，不同组分的乙二醇DES所萃取五味子油的萃取物DPPH清除能力变化不大，说明DES中两种组分的物质的量比对其萃取能力影响较小。

3 结论

本实所萃取得的物质均为淡黄色溶液。在不同种低共熔溶剂中，氢供体和氢受体的组成及比例决定了其物理化学性质，影响了其对溶质的溶解及萃取能力。对六种不同种类的DES溶剂和传统甲醇/水(80∶20)所萃取的七种五味子油萃取物全波段扫描，最大吸收波长在240～243 nm之间，其中最大吸收峰值是乙二醇DES组的2.723 Abs。

在过氧化氢清除率的的实验中，过氧化氢浓度的变化对各物质在242 nm的吸光度影响较小，可以理解为各物质对于过氧化物的抗氧化性较好。在接下来羟基自由基清除率实验 ，总还原力测定，DPPH清除率测量，超氧阴离子清除率测定中，乙二醇DES萃取的物质均为最佳，说明其具有较好的抗氧化力，可证明乙二醇DES的萃取能力较好。可以在一些特定环境下替代甲醇萃取五味子油。并且在实验中发现，研究中采用的低共熔溶剂和其对应的五味子油萃取物具有不同的黏度，其中乙二醇DES和乳酸DES黏度较低，实验操作较为方便，而其余四种低共熔溶剂的黏度均较大，难以量取和使用，要在一定的温度下保持其适中的黏度。也可说明乙二醇DES具有的较高萃取效率和较容易的操作条件，使之成为萃取五味子油有效成分的理想萃取剂。

最后比较不同组分物质的量比的DES萃取能力，选择萃取效果最好的乙二醇DES组，分别制备乙二醇与氯化胆碱五种不同物质的量比组成的低共熔溶剂，通过其萃取物的DPPH清除率的能力测定，结果表明不同组分物质的量比的DES萃取能力基本相同。证明低共熔溶剂中各组分的物质的量比对其萃取能力的影响不大。氯化胆碱和乙二醇的物质的量比为1∶2时，溶液密度大、黏度高，密度大可以提高溶质的溶解能力但相反，黏度大不利于萃取过程中物质的传递，随着氯化胆碱与乙二醇的物质的量比改变，之家乙二醇的比例，低共熔溶剂的密度减小同时黏度降低，这可能是导致不同低共熔溶剂萃取物抗氧化能力变化不大的原因。