N-掺杂石墨烯量子点的制备及荧光成像研究

张 坤，王楷淇，张 静，夏宇涵，杜宝萱，董 建

(山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016)

近年来，GQDs因其优异的光化学特性、良好的生物相容性引起了人们的广泛关注[1-2]。如何进一步提高GQDs的量子产率及拓展其应用领域是目前研究的热点问题。杂原子掺杂[3]是调节GQDs荧光性质，提高量子产率的有效方法，其中有关N-GQDs的研究最为广泛[4-5]。N-GQDs作为一种新型荧光纳米材料，在细胞成像、药物传输、生物传感等领域具有广阔的应用前景。

本论文以GQDs为碳源，三聚氰胺为氮源，采用高温热解而后硝酸氧化的方法制备N-GQDs，并对其微观形貌和光学性质进行表征。在此基础上，选用脑胶质瘤U251细胞对N-GQDs的细胞毒性和荧光成像性质进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GQDs：自制，具体方法见文献[2]；三聚氰胺：分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；硝酸、二甲亚砜(DMSO)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；RPMI培养基：Hyclone公司；MTT，4%多聚甲醛、青链霉素混合液、胰酶-EDTA消化液：北京索莱宝科技有限公司；新生牛血清：浙江天桥生物科技有限公司。

1.2 仪器设备

超声波振荡器：SB-12D型，宁波新艺超声设备公司；真空干燥箱，DZF-6020，上海精宏实验设备有限公司；高温管式炉：GSL-1600x型，合肥科晶材料技术有限公司；冷冻干燥机：SCIENTZ型，宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外暗箱：ZF-20D型，巩义市予华仪器有限公司；二氧化碳培养箱：3111型，Thermo Fisher Scientific公司；透射电子显微镜(TEM)：Tecnai G2 F20型，美国飞利浦公司；紫外分光光度计：U-3900型，日本Hitach公司；荧光分光光度计：F-4600型，日本Hitach公司；酶标仪：Infinite M200型，德国Tecon公司；荧光倒置显微镜：GPJ9-TS100型，日本尼康公司。

2 实验方法

2.1 N-GQDs的制备

将50 mg GQDs超声分散于100 mL去离子水中，然后加入0.25 g三聚氰胺，搅拌直至出现明显的沉降。将上述混合体系蒸干，真空干燥24 h，研成粉末。将粉末置于石英舟内，氩气保护下750℃热解45 min，然后用6 mol/L HNO3回流8 h，蒸干HNO3，透析纯化得到N-GQDs。

2.2 N-GQDs的形貌及光学性质表征

分别采用TEM、紫外分光光度计和荧光分光光度计对N-GQDs的微观形貌和光学性质进行表征；以硫酸奎宁在0.1 mol/L H2SO4(Q = 0.54，340 nm) 为参照，按照下列公式计算N-GQDs的量子产率。其中Q：量子产率，I：荧光发射峰积分面积，n：折射率，A：吸光度，R：指参考样品。

2.3 N-GQDs的细胞毒性测定

收集处于生长对数期的U251细胞，胰酶-EDTA消化后吹打得到细胞悬液(5×104个/mL)。将细胞悬液加入96孔板，放入37℃，5% CO2培养箱培养24 h。细胞贴壁后加入不同浓度的N-GQDs溶液20 μL，继续培养24 h。加入20 μL MTT，孵育4 h后终止培养。每孔加入150 μL DMSO，低速振荡10 min。用酶标仪测定各孔的吸光值(A)，测定波长为490 nm。细胞存活率= (A-Ablank/Acontrol-Ablank) ×100%，其中Blank为空白组；Control为对照组。

2.4 N-GQDs的细胞成像研究

收集处于生长对数期的U251细胞，将细胞悬液接种至细胞爬片，加入培养液培养24 h。继续加入N-GQDs溶液(2.5 μg/mL)培养12 h，PBS冲洗3次。取出细胞爬片，加入4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS清洗3次。将细胞爬片转移至载玻片上，封片固定。采用荧光倒置显微镜观察N-GQDs的细胞成像。

3 结果与讨论

3.1 N-GQDs的微观形貌

N-GQDs的TEM照片及其粒径分布如图1(a)和(b)所示。本方法制备的N-GQDs具有良好的分散性，粒径分布较为均匀，平均粒径约为3.5 nm。

图1 N-GQDs的TEM照片及其粒径分布

3.2 N-GQDs的光学性质

如图2所示，N-GQDs的紫外-可见吸收光谱在266 nm处有一个明显的肩峰，其归因于C=O的n-π*跃迁。由荧光光谱可知，N-GQDs的最佳激发波长为360 nm，其发射峰位于442 nm处。当激发波长由380 nm向480 nm转变时，发射峰发生明显的红移。在365 nm紫外灯照射下，N-GQDs呈现明显的蓝色荧光。N-GQDs的量子产率为15.8%，明显高于GQDs(0.8%)。

图2 N-GQDs的紫外-可见吸收光谱及荧光光谱图

3.3 N-GQDs的细胞毒性

图3 不同浓度N-GQDs孵育的U251细胞活力图

要将N-GQDs应用于生物成像领域，安全性是最基本的要求。由图3可见，在N-GQDs的浓度≤120 μg/mL的情况下，U251细胞24 h后的存活率一直保持在90%以上，表明N-GQDs细胞毒性小，可保证其后续细胞成像的安全性。

3.4 N-GQDs的细胞荧光成像

将N-GQDs与U251细胞共同孵育12 h后，置于荧光倒置显微镜下观察。如图4所示，N-GQDs可进入U251细胞，并呈现出明显的绿色荧光，这表明N-GQDs有望作为一种安全性较高的荧光标记物，应用于U251细胞成像。

图4 N-GQDs孵育的U251细胞的荧光成像照片

4 结论

本研究以GQDs为碳源，三聚氰胺为氮源，采用高温热解而后硝酸氧化的方法制备了一种尺寸分布较为均匀的N-GQDs。与GQDs相比，N-GQDs的量子产率显著增加。N-GQDs有望作为一种安全的荧光标记物，应用于U251细胞成像。