尿石清合剂质量标准的研究

杨素红，胡玉良，王英晶

（广州中医药大学附属中山中医院，广东中山528400）

尿石清合剂是中山市中医院新研发的制剂，由广金钱草、栀子、石韦、甘草、川牛膝、车前子、海金沙、滑石、冬葵果等九味药组成，具有清热利湿、通淋排石作用［1］，用于治疗尿路结石。为有效控制该制剂质量，确保疗效稳定，笔者参考《中华人民共和国药典》2015版一部及相关文献对其质量标准进行规范化研究。采用薄层色谱鉴别法［2］对制剂处方中车前子、川牛膝、石韦、广金钱草、栀子、甘草作定性鉴别，用高效液相色谱法对主要药味栀子的指标成分栀子苷作定量分析，从而为该制剂的质量标准建立提供参考。

1 仪器与试药

KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），JP-300A高速多功能粉碎机，Goodsee-I薄层色谱摄影仪（上海科哲生化科技有限公司），美国Agilent 1100系列高效液相色谱仪；栀子苷对照品（批号:110749-201316，供含量测定用，含量:97.5%）由中国食品药品检定研究院所提供；色谱纯（甲醇），纯化水，分析纯。尿石清合剂（批号:20170912、20171031、20171130、20171228），所用药材均购于广东致信药业有限公司，经鉴定符合《中国药典》2015版规定。

2 薄层色谱定性鉴别

2.1 车前子薄层色谱鉴别

取尿石清合剂10 mL，用水饱和正丁醇振摇提取 2次，每次 25 mL；合并正丁醇提取液，再用正丁醇饱和的水洗涤 2次，每次 25 mL；弃去水液，正丁醇液蒸干，加甲醇l mL使残渣溶解，加入中性氧化铝 1 g（100～200 目），拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱上（3 g，100～200目，内径 9 mm，干法装柱），用80%的甲醇30 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干；用甲醇1 mL使残渣溶解，作为供试品溶液。同法制成不含车前子的阴性对照溶液。另取粉碎后车前子对照药材2 g，加入甲醇20 mL，超声30 min后过滤，蒸干滤液，加甲醇2 mL溶解残渣，制成对照药材溶液。

色谱条件:吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-甲酸-水（16∶3∶1∶0.8）为展开剂展开，取出并晾干后，喷以含2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在80℃～85℃下加热至斑点显色清晰，置紫外灯光（365 nm）下检视。结果见图1。

图1 车前子TLC鉴别图

2.2 川牛膝薄层色谱鉴别

取样品10 mL，每次使用乙酸乙酯20 mL提取2次，合并乙酸乙酯溶液后蒸干，加入无水乙醇2 mL使残渣溶解，作为供试品溶液。取缺川牛膝的阴性溶液10 mL同法制备阴性对照溶液。取川牛膝2 g，加20 mL甲醇，超声30 min，过滤，滤液蒸干；残渣加甲醇2 mL溶解制成对照药材溶液。于同一硅胶G薄层板上，分别吸取供试品溶液、川牛膝对照药材溶液和阴性对照溶液各 5 μL点上，以氯仿-丙酮-甲 酸（15∶1∶0.2）为 展开剂，展开，取出并晾干后，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图2。

图2 川牛膝TLC鉴别图

2.3 栀子薄层色谱鉴别

取样品10 mL，加水饱和的正丁醇萃取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干后，用甲醇2 mL使残渣溶解，制得供试品溶液。取10 mL缺栀子的阴性样品，同法制备阴性对照溶液。另取栀子对照药材 0.5 g，加乙醇 20 mL，超声处理 20 min，滤过，滤液蒸干；加乙醇2 mL使残渣溶解，制得栀子对照药材溶液。于同一硅胶G薄层板上，分别吸取上述3种溶液各5 μL点上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2） 作为展开剂，展开，取出并晾干后，喷以10%硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热至斑点显色清晰。日光下检视，见图3。

图3 栀子TLC鉴别图

2.4 甘草薄 层色谱鉴别

取栀子项下供试品溶液作为供试品溶液。取缺甘草的阴性样品10 mL，同法制备阴性对照溶液。另取甘草对照药材0.5 g，加水适量湿润，加水饱和的正丁醇加20 mL，超声处理40 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，制得甘草对照药材溶液。吸取上述 3种溶液各 5 μL，于同一硅胶G薄层板分别点上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂展开，取出并晾干后，喷以10%硫酸乙醇溶液，置于105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，见图4。

图4 甘草TLC鉴别图

2.5 石韦薄层色谱鉴别［3-4］

取尿石清合剂10 mL，用乙酸乙酯-乙醇（8∶1）混合溶液提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇2 mL使残渣溶解，制得供试品溶液。取10 mL缺石韦的阴性溶液同法制得阴性对照溶液。取石韦3 g，水煮1 h，浓缩至20 mL，按供试品溶液同法制得对照药材溶液。于同一硅胶G薄层板上，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL、对照药材溶液 3μL点上，以氯仿-丙酮-甲酸（10∶2∶0.2）为展开剂展开，取出并晾干后，喷以5%三氯化铁乙醇溶液，置于105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，见图5。

图5 石韦TLC鉴别图

2.6 广金钱草薄层色谱鉴别［5-6］

取样品10 mL，加稀盐酸调节pH至2，用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加无水乙醇2 mL使残渣溶解，制得供试品溶液。取缺广金钱草的阴性溶液10 mL同法制得阴性对照溶液。取广金钱草3 g，水煎1 h，水煎液同法制得广金钱草对照药材溶液。分别吸取供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL，对照药材溶液3 μL，于同一硅胶 G薄层板点上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）为展开剂展开，取出并晾干后，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯（365 nm）下检视，见图6。

图6 广金钱草TLC鉴别图

3 栀子苷的含量测定［7-8］

3.1 色谱条件

色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶（Inertsil ODS-3，5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温 30 ℃；流动相:甲醇-水（30∶70）；检测波长:236 nm；流速:1 mL/min；进样量:20 μL。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液 精密称取栀子苷对照品适量，用50%甲醇稀释至0.02 mg/mL。

3.2.2 供试品溶液 精密量取 2 mL样品于 50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度线，摇匀，精密量取10 mL于20 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，过滤，作为供试品溶液。

3.2.3 阴性对照溶液 精密量取2 mL缺栀子的阴性溶液，按照样品处理方法同法制得阴性对照溶液。

3.3 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，按3.1项色谱条件进样检测。结果，供试品溶液色谱中有与对照品溶液色谱相对应的峰，且阴性无干扰（图7）。

图7 栀子苷含量色谱图

3.4 线性关系考察

分别精密量取栀子苷对照品溶液（0.02 mg/mL）0.5 mL，1 mL，2 mL，4 mL，8 mL 于 20 mL 容量瓶中，配成5个系列浓度的溶液，浓度分别为5 mg/μL，10 mg/μL，20 mg/μL，40 mg/μL，80 mg/μL，吸取上述各组溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，以峰面积对浓度进行回归分析，回归方程为:y=52 658x+12.088，r=0.999 7。结果表明栀子苷在5～80 mg/μL浓度范围内，线性关系良好。

3.5 精密度试验

取同一栀子苷对照品溶液，按“3.1”项下色谱条件，连续测定5次。按峰面积计算，测得栀子苷的RSD为1.52%，表明系统精密度良好。

3.6 稳定性试验

取“3.2.2”项下供试品溶液，分别置 0 h、1 h、3 h、6 h、24 h、48 h 后，按“3.1”项色谱条件测定，计算色谱中栀子苷的峰面积，RSD值为0.91%，表明样品溶液在48 h内基本稳定。

3.7 重现性试验

取尿石清合剂，按“3.2.2”项方法制备供试品5份，按“3.1”色谱条件测定栀子苷含量，样品栀子苷平均含量为 1.269 mg/mL，RSD为 1.72%.表明该法重现性良好。

3.8 加样回收率试验

取已知含量为1.269 mg/mL的尿石清合剂（批号20171228）样品5份，精密量取1 mL，分别精密加入栀子苷对照品溶液（0.3 mg/mL）2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL。再按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项色谱条件进样，计算回收率。结果平均回收率为 103.6%，RSD值为 1.59%。

3.9 样品含量测定

取 4批样品 （批号 20170912、20171031、20171130、20171228）按“3.2.2”项下制备供试品溶液，按“3.1”项色谱条件进行测定，记录峰面积，代入回归方程，计得含量。结果测得样品含量分别为1.216 mg/mL，1.472 mg/mL，1.651 mg/mL，1.269 mg/mL，平均含量为 1.402 mg/mL。

4 讨论

车前子中主要成分为车前子多糖，故可以采用极性大的溶剂处理。参考《中国药典》2015版第一部，并通过参考文献进行了改进，去掉了乙醚提取的过程。结果，供试品中有与对照药材相同的荧青黄色的斑点，且阴性无干扰，Rf值适中，特征性斑点清晰，分离度良好，具有专属性。药典中并无石韦的薄层色谱鉴别记载，直接用乙酸乙酯-乙醇（8∶1）震荡提取后，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解，所得结果理想，样品中具有与对照药材相同的斑点，Rf值适中，且阴性无干扰，操作简便，该法鉴别石韦具有一定的稳定性、可行性。尿石清合剂中川牛膝、栀子、甘草、广金钱草参考《中华人民共和国药典》2015版中方法亦能较好进行定性鉴别。

药典中栀子苷含量测定的流动相为乙腈-水（15∶85），但乙腈毒性大于甲醇，选择甲醇-水，调整比例后，主峰型分离度好，保留时间合适。

4批制剂中栀子苷的平均含量为1.402 mg/mL，考虑到栀子药材品质差异及生产工艺中的损耗，指标成分的含量限度以平均值的80%作为含量下限，即尿石清合剂中栀子苷的含量不得低于1.122 mg/mL。

本次研究拟定的薄层鉴别法和含量测定法，方便快捷、重现性好，可作为尿石清合剂的质量标准，能有效控制尿石清合剂的质量。