失荅剌知丸及其拆方对脑缺血再灌注大鼠海马区JNK蛋白表达的影响

王娜琳 贾孟辉 左艳丽 冯佳婷 马玉玮

【摘 要】目的：探討失荅刺知丸及拆方对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织JNK表达的影响。方法：将204只SD雄性大鼠按随机数字表法分为正常组、假手术组、模型组及干预组（包括失荅剌知丸组，失荅剌知丸拆方Ⅰ组、拆方Ⅱ组、拆方Ⅲ组），其中模型组及各干预组按时间点不同分为1d组、3d组和7d组，并予MACO线栓法制备脑缺血再灌注大鼠模型，同时干预组于每日固定时间灌胃，同时观察大鼠神经功能症状情况，以大鼠神经功能Garcia JH评分并记录，治疗后于相应时间取材。运用Western Blot法检测海马组织中p-JNK蛋白的含量，以p-JNK/GAPDH表示蛋白表达相对水平。结果：失荅剌知丸及各拆方组中的p-JNK蛋白表达量均有降低，且与灌药时间成正比（P<0.05）;失荅剌知丸原方较各拆方组蛋白表达均低，其中拆方Ⅰ组最高，拆方Ⅱ组最低，拆方Ⅲ组次之（P<0.05）。神经功能评分结论与p-JNK蛋白表达结果一致。结论：失荅剌知丸原方及各拆方组均具有改善脑缺血后神经功能、抗神经细胞凋亡作用，而这可能与本实验所研究的JNK蛋白下调有关;其中，除原方外，又以拆方Ⅱ组作用效果最好，考虑该组可能在失荅剌知丸原方中发挥君药、或君药加臣药的主要作用。

【关键词】失荅剌知丸;拆方研究;JNK;神经功能评分

【中图分类号】R29【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）20-0019-04

Abstract：Objective To investigate the effects of the Shidalazhiwan and its dismantling prescriptions on the expression of JNK in the brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion.Methods 204 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group， sham operation group， model group and intervention group （including the Shidalazhiwan group， the Dismantling prescription group I， the Dismantling prescription group II， the Dismantling prescription group III）， in which the model group and the intervention group were divided into 1d group， 3d group and 7d group according to the time point， and the rat model of cerebral ischemia-reperfusion was prepared by MACO suture method， and the intervention group was fixed daily. At the same time， the neurological symptoms of the rats were observed， and the neurological function Garcia JH score will be scored and recorded. After the treatment， the materials were taken at the corresponding time.The content of p-JNK protein in hippocampus was detected by Western Blot， and the relative level of protein expression was expressed by p-JNK/GAPDH.Results The expression levels of p-JNK protein in the Shidalazhiwan and the disassembled prescription groups were all decreased， and it was proportional to the time of drug injection （P<0.05）.The original expression of Shidalazhiwan was lower than that of the disassembled prescriptions. The disassembled group I was the highest， the disassembled group II was the lowest， and the disassembled group III was the second （P<0.05）. The neurological function score was consistent with the p-JNK protein expression.Conclusion The original Shidalazhiwan and the disintegration prescriptions have the effects of improving neurological function and anti-neuronal apoptosis after cerebral ischemia， which may be related to the down-regulation of JNK protein studied in this experiment. The effect of dismantling prescription II is the best. Considering that this group may play the main role of the drug in the original prescription of the sputum， or the drug of the genus.

Keywords：Shidalazhiwan，Dismantling prescriptions research，JNK，Neurological function score

脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是指脑组织缺血性卒中发生时经过机械或化学治疗后，脑血管血流重建而引起的损伤[1]，其损伤的主要形式是神经细胞的凋亡，临床以神经功能损伤为主要症状。JNK即应激活化蛋白激酶（stress activated kinase，SAPK），是MAPK家族的主要成员之一[2]。研究表明，JNK信号通路与细胞凋亡过程密切相关[3]，其可促进大鼠脑缺血再灌注海马区神经元的凋亡[4]。本课题组前期研究已证实，失荅剌知丸可改善CIRI大鼠神经功能损伤症状，促进神经干细胞增殖，抑制神经细胞凋亡[5-7]。脑缺血再灌注模型是最接近人类脑梗死的理想大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型[8]。因此，本实验通过对失荅剌知丸及其拆方对脑缺血再灌注模型大鼠JNK信号通路的影响观察，以进一步探讨失荅剌知丸原方组成及各部分不同效果。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 本实验动物由宁夏医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK（宁）2015-0001。用SPF级体重为（230±20）g的SD雄性大鼠102只。大鼠适应饲养7 d后，按随机数字表法分为假手术组（A组，6只），正常组（B组，6只），模型组（D组，18只），干预组：包括失荅剌知丸组（E组，18只）、拆方Ⅰ组（C组，18只）、拆方Ⅱ组（F组，18只）、拆方Ⅲ组（G组，18只）。模型及各干预组按时间点不同又分别分为1 d、3 d、7 d组。

1.2 药物 失荅剌知丸：柴胡31g，黑诃子31g，撒额冰（阿魏）9g，芦荟62g，白芥子9g，失荅剌知（血根草）6g，沙哈木罕荅里（药西瓜）9g，胡椒3g，安息香9g，巴豆霜9g，菖蒲6g，番盐6g，阿里公（松蕈）9g，干姜9g，荜拨9g，芸香9g（《回回药方》原配方比例折算成公制克，药物剂量换算依据：一两约等于16.5克）。

拆方Ⅰ组：巴豆霜9g;拆方Ⅱ组：巴豆霜9g，柴胡31g，黑诃子31g，芦荟62g;拆方Ⅲ组：巴豆霜9g，撒额冰（阿魏）9g，白芥子9g，失荅剌知（血根草）6g，沙哈木罕荅里（药西瓜）9g，胡椒3g，安息香9g，菖蒲6g，番盐6g，阿里公（松蕈）9g，干姜9g，荜拨9g，芸香9g。

药物由宁夏医科大学第二附属医院药剂科提供，上各方按传统煎煮法煎煮并浓缩，浓缩药物浓度为4.5g/mL。

1.3 造模 模型组及各干预组采用改良的Longa造模法[9]，即线栓法制备大鼠左侧中动脉供血不足的脑缺血再灌注（MACO）模型。造模方法：术前禁食12h，予水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠取仰卧位，固定四肢及头部，备皮暴露颈部皮肤并消毒，沿颈中线开一约2cm开口，钝性分离大鼠左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，将消毒好的线栓插入5mL注射器针头，线栓钝圆头漏于注射器针尖外部，沿颈外動脉靠近三者分叉处向颈总方向插入约5mm，借助注射器针头继续将线栓插入颈总后拔出注射器针头，将线栓轻轻缓慢退出至分叉处后插入颈内动脉，插入深度约16～18mm，用缝合线将线栓固定，缝皮，2h后打开缝合线，拔线栓至有阻力时停止，剪去线栓，缝合黏膜及皮肤，消毒。期间均使大鼠位于干净温暖的笼盒中，待大鼠清醒后单独饲养观察。

1.4 干预治疗 各干预组药物根据大鼠体表面积剂量换算公式[10]计算给药量为4.5g/mL，给药剂量为1mL/100g、2次/d。剩余各对照组（正常组、假手术组、模型组）均以生理盐水灌胃，灌胃剂量同药物剂量即1mL/100g、2次/d。

1.5 取材方法 各干预组及模型组取材时间依据各不同时间点进行，正常组及假手术组于灌胃7 d后取材。以水合氯醛腹腔麻醉法进行大鼠麻醉后断头处死，快速取出脑组织，并于冰上迅速剥离海马保存于-80℃冰箱中。

1.6 指标检测方法

1.6.1 神经功能评分 取材前进行大鼠神经功能评分并记录，评分采用Garcia JH评分[11]，通过评估各组大鼠自主运动情况、体态的对称性、前肢伸展运动、网屏实验、两侧身体触觉反射及两侧胡须触觉反射情况，评分统计，评分区间为0-18分。

1.6.2 Western Blot检测蛋白表达水平 实验按照WB检测方法进行操作，用ImagaJ软件分析灰度值，以目的蛋白/内参即p-JNK/GADPH灰度值的比值表示蛋白表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0进行数据整理分析，各组数据先进行正态分布检验及方差齐性的检验，其中，符合正太分布及方差齐的，组间比较采用单因素方差分析，不符合的进行数据转换后分析;多组间比较则采用LSD法进行量量比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能Garcia JH评分 如表1所示，正常组与假手术组同期比较差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组及假手术组比较，模型组及各干预组评分均低于空白组及假手术组（P<0.05）。与灌胃1d组比较，模型组及各干预组灌胃3d、7d组评分均明显增加（P<0.05）。与灌胃3d组比较，模型组及各干预组灌胃7d时评分均明显增加（P<0.05）。与模型组同期比较，各干预组评分均高于模型组（P<0.05）。与失荅剌知丸组同期比较各拆方组评分均低于失荅剌知丸组（P<0.05）。与拆方Ⅰ组同期比较，拆方Ⅱ、Ⅲ组评分均高于拆方Ⅰ组（P<0.05）。与拆方Ⅱ组同期比较，拆方Ⅲ组评分低于拆方Ⅱ组（P<0.05）。

2.2 Western Blot检测结果 如图1、图2所示，各组方差齐性概率均>0.05，认为方差齐。其表达结果显示如下：假手术组与正常组表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。与假手术组及正常组同期比较，模型及各干预组蛋白表达均高于假手术组及正常组（P<0.05）。与灌胃1d组比较，模型组及各干预组3、7d时p-JNK蛋白表达均有降低（P<0.05）。与灌胃3d组比较，模型组及各干预组灌胃7d时p-JNK蛋白表达均有明显降低（P<0.05）。与模型组同期比较，各干预组p-JNK蛋白表达均低于模型组（P<0.05）。与失荅剌知丸组同期比较，各拆方组蛋白表达均高于失荅剌知丸组（P<0.05）。与拆方Ⅰ组比较，拆方Ⅱ、Ⅲ组p-JNK蛋白表达均低于拆方Ⅰ组（P<0.05）。与拆方Ⅱ组比较，拆方Ⅲp-JNK蛋白表达高于拆方Ⅱ组（P<0.05）。

3 讨论

缺血性卒中的病理基础以脑血流动力学的改变为主，随着年龄的增长以及各种老年病和血管疾病的发生，颅内外动脉变构[12]，血栓形成和栓子脱落的风险增加，从而导致了本病的发生。本病致残率极高，以神经功能缺损为主要表现[13]。本病治疗的关键是脑缺血后脑血流的恢复，但再灌注往往可加重脑缺血组织的损伤[14]，神经细胞缺血再灌注损伤导致JNK激活[15]，JNK通路对凋亡的调节至关重要[16]。JNK蛋白激酶有3個基因10种亚型，抑制其活化可降低脑组织的损伤[17]。失荅剌知丸出自《回回药方》残卷十二“众风门”篇，原方载“能开缠肠肚风病，最通经络”[18]，可知其以治疗脑中风经络不通所致口眼喎斜、半身不遂等症。且前期课题组研究已知该方高剂量组用于治疗缺血性中风时效果优于尼莫地平[5-7]，对其进一步的研究应用更值得探索。观察原方组成知其以化痰通络、芳香利湿为主，但因其药方中有多味不常用药，且其中巴豆、芦荟等用量较大，临床应用多有顾忌，故研究其组方特点进行本实验。

本实验研究结果表明，失荅剌知丸可明显降低大鼠脑损伤症状，改善大鼠神经功能，下调JNK蛋白表达，减低凋亡发生。其各拆方组中，以拆方Ⅱ组（即巴豆霜、柴胡、黑诃子、芦荟）表达结果最具优势，考虑该组药物可能为失荅剌知丸发挥治疗作用的主要药物组成，以君臣佐使配伍理论探讨该方组成，考虑该四味药物可能是该方的君药或君臣药。后期可对失荅剌知丸进一步探索，以探讨其治疗机制及组方原则。

参考文献

[1]AL-MUFTI F， AMULURU K， ROTH W， et al. Cerebral Ischemic Reperfusion Injury Following Recanalization of Large Vessel Occlusions[J]. Neurosurgery， 2018，82（6）：781-789.

[2]刘婷婷， 张淑萍， 覃筱燕， 等. MAPK信号转导通路与神经损伤研究进展[J]. 中国公共卫生， 2016，32（2）：248-254.

[3]CHUN J M N K. An ethyl acetate fraction derived from Houttuynia cordata extract inhibits the production of inflammatory markers by suppressing NF- к B and MAPK activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages[J]. BMC Complement Altern Med， 2014（14）：234.

[4]张霞， 钱涛， 高维娟， 等. JNK通路促进大鼠脑缺血再灌注海马神经元凋亡[J]. 中国病理生理杂志， 2012，28（8）：1431-1435.

[5]李宏伟， 贾孟辉， 黑晓英， 等. 失荅剌知丸对脑缺血再灌注大鼠海马区神经干细胞增殖的影响[J]. 河北中医， 2018，40（3）：405-410.

[6]左艳丽， 贾孟辉， 于凌志， 等. 回药失荅剌知丸抗大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡的实验研究[J]. 中国民族民间医药， 2016，25（5）：73-76.

[7]于凌志， 贾孟辉， 左艳丽， 等. 失荅剌知丸改善脑缺血再灌注模型大鼠神经功能的抗凋亡相关机制研究[J]. 宁夏医科大学学报， 2016，38（2）：120-124.

[8]潘洲佳， 顾佳楠， 谢竹青， 等. 脑缺血再灌注模型制作方法的研究进展[J]. 医学综述， 2019（14）：2801-2805.

[9]ZLE， RWP， SC， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke; a journal of cerebral circulation， 1989，20（1）.

[10]陈奇. 中药药理研究方法学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2006： 36， 1204.

[11]程发峰， 宋文婷， 郭少英， 等. 三种神经功能评分在鼠类局灶性脑缺血模型评价中的比较[J]. 中国康复医学杂志， 2011，26（4）：337-341.

[12]周华东. 缺血性卒中发生的病理基础——颅内外动脉变构致病理论[J]. 重庆医学， 2014，43（1）：1-4.

[13]郭涛， 任璐， 何红云， 等. 自噬及其在缺血性脑中风中双重作用的研究进展[J]. 中西医结合心脑血管病杂志， 2019，17（9）：1339-1342.

[14]刘莎莎， 高维娟， 钱涛， 等. 黄芪注射液对脑缺血/再灌注大鼠海马组织JNK-3表达的影响[J]. 中国药理学通报， 2012，28（5）：665-670.

[15]王巧云， 刘凤， 吴峰阶， 等. 人参皂苷Rg1对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马p-ERK1/2与p-JNK表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志， 2013，33（2）：229-234.

[16]KIM A D， KANG K A， KIM H S， et al. A ginseng metabolite， compound K， induces autophagy and apoptosis via generation of reactive oxygen species and activation of JNK in human colon cancer cells[J]. Cell Death & Disease， 2013，4（8）：e750.

[17]丁超， 王训， 程楠. c-Jun氨基末端激酶信号转导在神经元损伤中作用[J]. 安徽医学， 2014，35（3）：397-399.

[18]贾孟辉. 《回回药方》残本注评[M]. 银川： 阳光出版社， 2015： 12， 465.

（收稿日期：2019-08-28 编辑：刘斌）