胎膜早破孕妇B族链球菌感染以及相关蛋白的表达情况分析

周娴 胡燕玲

1江汉大学医学院（武汉430056）；2武汉市中心医院（武汉430014）

胎膜早破即临产前孕妇胎膜出现破裂情况，具有发病率高及病情危害大的特征，极易引起胎儿窒息、早产、胎儿窘迫、脐带脱垂以及难产等，影响母婴结局［1］。胎膜早破致病因素尚不明确，临床多认为生殖道感染是该疾病的诱因之一，而引起生殖道感染的一种细菌即B 族链球菌，但B 族链球菌与胎膜早破的关系仍处于研究阶段，相关资料也鲜有报道［2］。近年来，有研究发现细胞过度凋亡可能会引起胎膜早破，B 细胞淋巴瘤基因-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）以及Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）均为凋亡调控基因，但两种蛋白在胎膜早破孕妇中的作用仍存在争议。已有学者［3］对胎膜早破绒毛膜羊膜碱性成纤维细胞生长因子与Bax、Bcl-2 的表达进行研究，但对于胎膜早破孕妇B 族链球菌感染以及相关蛋白的表达情况的研究却鲜有报道。对此，为分析胎膜早破孕妇的B 族链球菌感染情况及相关蛋白的表达情况，进一步验证B 族链球菌与胎膜早破的关系及Bcl-2 和Bax 对胎膜早破孕妇中的作用，此次以武汉市中心医院2016年12月至2019年2月收治的60 例胎膜早破孕妇及60 例无胎膜早破孕妇为对象展开研究，旨在为胎膜早破的预防及干预提供理论依据，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象以武汉市中心医院2016年12月至2019年2月收治的60 例足月胎膜早破孕妇为观察组，年龄22 ～33 岁，平均（27.61 ± 1.33）岁；孕周37 ～41 周，平均（38.97 ± 0.32）周；产次1 ～3 次，平均（1.58 ± 0.26）次；体质量60 ～83 kg，平均（71.59± 3.73）kg。同期选取60 例足月无胎膜早破孕妇为对照组，年龄21 ～34岁，平均（27.59±1.42）岁；孕周38 ～41 周，平均（39.26 ± 0.29）周；产次1 ～3 次，平均（1.60±0.23）次；体质量61 ～82 kg，平均（71.61±3.69）kg。两组孕妇年龄、孕周、产次以及体质量等一般资料对比差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。本研究经医院伦理委员会批准（编号：1906604）。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准（1）满足《妇产科学》［4］中与“胎膜早破”相关标准相符者；（2）沟通能力良好；（3）精神状态正常；（4）破膜12 h 内接受终止妊娠；（5）患者或其家属签署知情同意书。

1.2.2 排除标准（1）合并心脏病；（2）合并妊高症；（3）合并血液系统疾病；（4）合并妊娠期糖尿病；（5）入院前7 d 内曾出现病毒感染或者细菌感染，且接受抗生素治疗。

1.2.3 实验材料（1）主要仪器：光学显微镜选购于奥林巴斯有限公司，切片机购于德国徕卡，载玻片购于世泰有限公司，电烤箱购于格兰仕，高压蒸汽灭菌锅购于上海博迅实业有限公司；（2）主要试剂：二甲苯溶液选购于南京新凯化工有限公司，乙醇选购于国药集团，苏木素购精购于贝索有限公司，1%盐酸乙醇溶液购于上海榕柏生物技术有限公司，0.5%氨水溶液购于巨能世纪信息科技（苏州）有限公司，中性树胶购于莱科医疗仪器有限公司，磷酸盐缓冲液、二抗、抗原修复液以及抗体稀释液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司，3%过氧化氢溶液购于赫澎（上海）生物科技有限公司，封闭用正常山羊血清工作液购于北京百奥莱博，Bcl-2 以及Bax 试剂均购于Arigo，通用型二氨基联苯胺显色溶液购于赫澎（上海）生物科技，1%盐酸酒精购于上海榕柏生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采集样本（1）孕35 ～37 周时，对孕妇肛周、阴道下侧1/3 处的分泌物进行提取，进行专业培养，待孕妇入院后对B 族链球菌的测定结果进行追溯；（2）胎盘分娩后，对胎膜组织样本进行提取，定位孕妇胎膜口约4 cm 点，对胎膜组织进行剪取，面积3 cm × 3 cm，以生理盐水对样本组织表面的羊水以及血迹进行反复冲洗后，以福尔马林妥善固定。给予胎膜组织常规包埋，对蜡块标本切片处理，厚度控制在4 μm 左右，并选取其中较为满意的2 张切片；（3）对2 张切片分别进行Bcl-2及Bax 免疫组化染色，观察其表达情况。

1.3.2 测定B 族链球菌于琼脂上接种胎膜样本，放置于37 ℃的黑暗有氧环境中，培养1 d 观察典型菌落，若1 d 后无典型菌落出现，延长培养时间至2 d。

1.3.3 苏木精-伊红染色（1）以蒸馏水冲洗胎膜组织表面固定液，取足量组织放置于标本框中，标记取材顺序，予以脱水。以75%乙醇对胎膜组织进行浸泡，12 h 后分别置入85%、90%、95%乙醇及无水乙醇中浸泡1 h，取出后再用二甲苯溶液予以浸泡1 h，2 次，1 h/次。加热石蜡后，置入模具，并将样本组织放入模具内；（2）以切片机对蜡块进行切片，厚度控制4 μm 左右，再将切片妥善放入展片器中，放于载玻片表面，于室温环境下将其晾干，置入电烤箱（维持60 ℃恒温）内过夜，并于每张蜡块内选取4 张满意切片；（3）将切片放置于二甲苯溶液内，予以常规脱蜡15 min 后，置入无水乙醇内浸泡，2 次，5 min/次，将二甲苯充分洗净后，分别以95%、80%及70%的乙醇进行5 min 处理，再用自来水进行3 min 冲洗，并用苏木素予以染色，3 min 后再次以自来水进行1 min 冲洗，放入1%盐酸乙醇溶液中进行分化，1 min 后以自来水进行1 min 冲洗，置于0.5%氨水溶液中反蓝，约20 s 后再次用自来水对其冲洗1 min，予以伊红染色，2 min后以自来水进行1 min 冲洗，依次放入70%、80%乙醇内脱水5 min，再依次放入95%以及无水乙醇中予以5 min 浸泡，连续2 次后，以二甲苯进行透明处理，2 次，10 min/次，最后以中性树胶对其进行封片，置于显微镜下分析与观察。

1.3.4 免疫组化检验（1）将切片放入二甲苯中进行浸泡，2 次，10 min/次，依次以无水乙醇、95%及70%乙醇进行5 min浸泡，并以蒸馏水清洗1 min后，再以磷酸盐缓冲液进行冲洗，2 次，5 min/次；（2）切片妥善放在载玻架上，将抗原修复液加入切片表面，放入高压蒸汽锅内，将其煮沸，2 min 后取出冷却，再用磷酸盐缓冲液进行冲洗，2 次，5 min/次；（3）于切片表面滴入3%过氧化氢溶液，于室温环境中放置3 min 后，以磷酸盐缓冲液进行冲洗，2 次，5 min/次；（4）于切片表面滴加封闭用正常山羊血清工作液，静置20 min后，去除多余的液体，将切片妥善放进湿盒内，分别滴加50 μL Bcl-2以及Bax一抗，静置1 h 后，以磷酸盐缓冲液进行冲洗，3 次，5 min/次；（5）滴加40 μL 二抗，静置1 h 后，再以磷酸盐缓冲液进行冲洗，3 次，5 min/次，于切片表面滴加通用型二氨基联苯胺显色溶液，于镜下控制、观察显色时间；（6）以自来水对切片进行10 min 冲洗，终止反应后，去除表面液体，以苏木精进行复染，2 min后将切片放入1%盐酸酒精中，使其分化后，用自来水进行15 min冲洗，再根据1.3.3中流程进行常规脱水处理、透明处理、封片以及镜检。

1.4 判读结果（1）免疫组化检测的阳性标准［5］：于光学显微镜×200下对切片进行观察，选择5个高倍视镜，观察细胞膜以及细胞浆，以其是否有棕黄色的颗粒出现为依据对表达性质进行判断，并对染色强度分数及阳性细胞组织比例得分的总和进行计算，取平均值，即可获取阳性表达强度。（2）阳性细胞组织的比例标准［6］：0 分：未出现阳性细胞；1分：阳性细胞组织的比例不足25%；2分：阳性细胞组织的比例在25%～50%之间；3 分：阳性细胞组织的比例超过50%。（3）染色强度的评分标准［7］：0 分：不着色；1分：淡黄色；2分：棕黄；3分：棕褐。阳性表达度为0 分时即为阴性（-），弱阳性（+）为1 ～2 分，阳性（++）为3 ～4 分，强阳性（+++）为5 ～6 分。（4）B族链球菌的阳性标准［8］：可见培养基中出现浅粉至红色菌落，以珍珠状为主。

1.5 统计学方法以SPSS 20.0 软件进行分析，剂量资料以（）表示，予以t检验，例（%）表示计数资料，χ2检验，以多元线性回归或Spearman秩相关展开相关性分析，并以Graphpad Prism 7默认参数对ROC曲线展开分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 B 族链球菌感染情况观察组中，有22 例B族链球菌感染，感染率是36.67%，比对照组的10例（16.67%）高，差异有统计学意义（χ2= 6.136，P= 0.013）。120 例孕妇中，共有32 例B 族链球菌感染，总感染率是26.67%。

2.2 Bcl-2 阳性表达及Bax 阳性表达的特征Bcl-2 阳性表达的特征：胞浆内、绒毛膜细胞组织内以及羊膜上皮细胞膜中均有棕黄色颗粒存在，见图1。且Bcl-2表达强度不断增强，患者胎膜早破发生的风险性随之降低，两者间表现出剂量反应关系。Bax阳性表达的特征：胞浆中、绒毛细胞组织中以及羊膜上皮细胞膜中有棕黄色颗粒大量分布，见图2。且Bax 表达的强度增加，其胎膜早破的发生风险也会随之增加，两者间表现出剂量反应关系。

2.3 胎膜早破与Bcl-2 表达及Bax 表达的关系观察组患者Bcl-2 阳性表达率45.00%，比对照组的86.67%低，而观察组患者是Bax 阳性表达率是85.00%，比对照组的51.67%高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。两组孕妇Bcl-2 表达及Bax 表达强度见表2。根据表2可见，Bcl-2 及Bax 阳性表达均与胎膜早破存在关系，且Bcl-2 表达强度与胎膜早破发生风险呈负相关，Bcl-2 表达强度增加，胎膜早破发生风险降低，具有剂量反应关系，χ2趋势= 13.571，P＜0.001，且根据OR值发现，Bcl-2 是胎膜早破的保护性因素；而Bax 表达强度与胎膜早破发生风险呈正相关，Bax 表达强度增加，胎膜早破发生风险也升高，具有剂量反应关系，χ2趋势= 17.153，P＜0.001，且根据OR值发现，Bax 是胎膜早破的危险因素。

图1 Bcl-2 表达图像Fig.1 Bcl-2 expression image

图2 Bax 表达图像Fig.2 Bax expression image

2.4 Bcl-2 表达及Bax 表达间的关系采用2*C表分类资料的关联性分析方法计算χ2= 21.273 ＞= 11.34（P＜0.05），说明观察组患者胎盘组织中的Bcl-2 及Bax 表达间存在相关性，关联强度r= 0.389。

表1 两组孕妇Bcl-2 表达及Bax 表达比较Tab.1 Comparison of Bcl-2 expression and Bax expression between the two groups of pregnant women 例（%）

表2 两组孕妇Bcl-2 表达及Bax 表达强度Tab.2 Bcl-2 expression and Bax expression intensity in two groups of pregnant women 例

2.5 B 族链球菌感染的分层情况下胎膜早破与Bcl-2 表达及Bax 表达的关系观察组22 例B 族链球菌阳性，38 例阴性，对照组10 例B 族链球菌阳性，50 例阴性。存在B 族链球菌感染时，两组患者Bcl-2 表达及Bax 表达组间对比差异无统计学意义（P＞0.05）；未存在B 族链球菌感染时，观察组患者Bcl-2 阳性表达率55.26%，比对照组的88.00%低，而观察组Bax 阳性表达率89.47%，比对照组的54.00%高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 B 族链球菌对胎膜早破与Bcl-2 表达及Bax 表达的关系的影响Tab.3 Effect of group B streptococcus on premature rupture of membranes and expression of Bcl-2 and Bax expression 例（%）

3 讨论

胎膜早破在妊娠中晚期孕妇中的发生率较高，约10%左右，是引起难产、产褥感染以及胎儿窘迫等不良妊娠结局的主要因素之一，严重的情况下还可能引起胎儿死亡［9］。临床研究［10-11］发现，多种因素以及基因调控的综合影响下，胎膜细胞组织的凋亡速度会加快，不仅会破坏胎膜结构，还会使其功能受损，导致胎膜延展性降低，引起胎膜早破，因此认为胎膜细胞组织的过度凋亡与胎膜早破之间存在一定联系。

B 族链球菌寄生于人体泌尿生殖系统、空肠、大肠以及回肠中，以球形为主，经革兰染色后呈现出紫色，健康人身体中B 族链球菌的携带率超过35%，而孕妇携带率介于10%～30%间［12］。本次纳入研究的120 例孕妇B 族链球菌总感染率是26.67%，与既往资料相符。B 族链球菌会对绒毛膜产生作用，具有较强的穿透力以及黏附力，B 族链球菌感染导致炎性细胞组织大量生成，并发挥吞噬作用，同时B 族链球菌感染还可能会促使蛋白水解酶生成，并对胎膜组织产生影响，使其延展性受损，引起胎膜早破［13］。本次研究对60 例胎膜早破孕妇及60 例无胎膜早破孕妇展开分析，发现胎膜早破孕妇中B 族链球菌感染率是36.67%，比无胎膜早破孕妇中的16.67%高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明胎膜早破孕妇B 族链球菌感染的概率较高，而B 族链球菌则是引起胎膜早破的一种危险因素。

大量研究资料［14-15］显示，氧化应激、感染、细胞凋亡以及免疫等因素均可能引起胎膜早破。胎膜中含有大量胶原纤维，直接决定胎膜张力水平，一旦胶原纤维韧性、完整状态受损，胎膜组织抗张力性随之降低，同时弹性也会受到影响，引起胎膜早破［16］。细胞凋亡为人体细胞组织按照程序逐渐死亡的一种形式，为正常生理过程，随着内外环境的不断改变，基于基因调控作用下，细胞组织出现程序性死亡是人体稳步发展的前提条件，细胞凋亡能够使其身体中多余细胞组织、受损细胞组织及时清除［17］。研究［18］发现，多种疾病的出现以及病情发展都与细胞凋亡存在密切联系，人体处于健康状态时，其体内细胞凋亡增值及其死亡处于平衡水平，如果该平衡状态被破坏，细胞凋亡过程就可能出现异常调控，导致有害细胞组织大量存活，引起疾病。Bcl-2 以及Bax 均为细胞凋亡蛋白基因，而且还是Bcl-2 家族中的一对调控凋亡基因，Bcl-2 家族的构成成分包括大量促Bax 蛋白以及Bcl-2 蛋白，对于内源性通路起着调控作用［19］。MIKHAILOV［20］等研究表明，胎膜组织中细胞出现过度凋亡是引起胎膜早破的主要因素之一，Bcl-2表达异常降低，同时Bax 表达明显升高，使胎膜组织结构呈现出变薄、弱化或者老化等异常改变，影响胎膜功能及其组织张力，一旦宫腔压力在胎膜组织所能承受压力之上，就可能引起胎膜早破。本次研究发现，观察组患者Bcl-2 阳性表达率比对照组低，而Bax 阳性表达率比对照组高，差异有统计学意义，且观察组患者Bcl-2 及Bax 表达间呈负相关（P＜0.05），表明Bcl-2 及Bax 表达均在胎膜早破中起着参与作用，且Bcl-2 表达强调降低、Bax 表达强度升高，胎膜早破发生风险也随之增加，原因可能是Bcl-2 及Bax 表达失衡，导致胎膜细胞组织的凋亡基因受影响，发挥促凋亡作用，进而导致胎膜早破。此外，本次研究还发现，未存在B 族链球菌感染时，胎膜早破孕妇Bcl-2 阳性表达率比未胎膜早破孕妇的低，而Bax 阳性表达率比胎膜早破孕妇的高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明B族链球菌感染还会对胎膜早破与Bcl-2 表达及Bax表达的关系产生影响。

综上所述，孕妇出现胎膜早破的危险性因素之一即B 族链球菌感染，不仅Bcl-2 低表达、Bax 高表达会增加胎膜早破风险，而且B 族链球菌感染会对Bcl-2 及Bax 表达与胎膜早破间的关系产生影响。本次实验较以往研究，不仅证实B 族链球菌感染与胎膜早破的关系，也为Bcl-2 及Bax 对胎膜早破孕妇中的作用提供有力证据。