结直肠癌化学性放射增敏剂的研究进展

彭湃澜，廖斐综述 董卫国审校

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发病率每年都在增加，2015年中国癌症统计数据显示我国结直肠癌的发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中排名第5位，多数患者发现时已处于中晚期[1]。对于局部肿瘤病灶外侵固定无法手术或手术无法切净的病例，临床上通常在术中术后对肿瘤进行局部放疗[2]。对CRC进行放射治疗的主要难点包括肿瘤的放射抵抗性、肠周围正常组织器官对放射线的耐受性等问题，这些影响了放疗剂量的给予，限制了放疗在结直肠癌治疗中的应用。因此，需要进一步探索结直肠癌对放射治疗反应的潜在机制，寻找一些有前途的放射增敏剂来增强辐射对肿瘤组织的损伤。

放射治疗(radiation therapy ，RT)的基本原理是电离辐射(ionizing radiation，IR)与肿瘤细胞内物质通过直接和间接损伤效应两种途径产生相互作用。在电离辐射作用下，可直接损伤一些生物分子，例如蛋白质和类脂质，尤其是DNA，它是IR的首要效应物。DNA遭到破坏后可导致细胞分裂和周期阻滞，甚至出现细胞凋亡坏死。间接效应则是通过自由基破坏生物分子，很大程度上是由活性氧(ROS)通过化学反应导致生物分子的结构破坏，例如DNA的单链断裂(SSBs)或双链断裂(DSBs)以及DNA-DNA或DNA-蛋白质的交联，导致细胞死亡[3-4]。当细胞出现DSB后还可出现多种修复途径以维持基因组的完整性并防止错误修复和染色体重排[5]。基于上述DNA损伤和修复的机制，促进了各种放射增敏剂的发展。根据不同的成分及结构，将放射增敏剂分为3类，即化学性放射增敏剂、分子放射增敏剂和纳米放射增敏剂。本文按DNA损伤修复的不同作用机制分类，就近年化学性放射增敏剂在结直肠癌中的研究进展作一综述。

1 直接损伤途径：协同效应

奥沙利铂是烷基化抗癌药物家族中的铂类化合物，通过与DNA的双链结构之间形成加合物，干扰DNA的生物合成而产生抗肿瘤活性。奥沙利铂还可通过诱导G2/M细胞周期停滞，阻断DNA复制和抑制转录等机制增强辐射诱导的细胞毒性，最终出现协同效应诱导不可逆的DNA损伤[6]。奥沙利铂作为放射增敏剂目前已进入I～III期临床试验，几项I期和II期研究对奥沙利铂加入标准放化疗方案中的治疗效果进行了评估，其结果显示治疗方案中化疗药物的毒性反应增加，而没有取得额外的治疗益处[7-8]。作为第三代铂类药物，奥沙利铂目前已被批准用于结直肠癌的治疗[9]，但目前对直肠癌的标准治疗未将奥沙利铂加入术前新辅助放化疗方案，在报告III期临床试验数据后，该建议可能会得到改变。

2 间接损伤途径：自由基损伤

放疗时产生的间接效应很大程度上是由活性氧产生ROS引起的。 ROS通过破坏生物分子和激活相关信号通路而促进肿瘤细胞发生凋亡[10-12]。含有两个不成对电子的氧可以被归类为自由基，是放射增敏剂的原型。氧可以快速添加到许多其他自由基中，增强生物分子的损伤反应，产生新的反应性自由基，并且促进级联反应。另一方面，包括结肠癌在内的大多数实体瘤均存在乏氧区域，缺氧期间可用的氧分子降低，减少ROS的产生，减弱DNA损伤效应，这是肿瘤组织对放疗产生抵抗的一个主要生物因素。低氧合的实体瘤通常比良好氧合(含氧量正常)的肿瘤更耐放射线，需要更高剂量的IR用于治疗[13-15]。因此，改善肿瘤对放疗敏感性研究的另一策略是将缺氧细胞作为肿瘤特异性靶标，用于改善对电离辐射的反应性。

2.1 氧及其模拟物 氧气具有电子亲和力的特性，是较早提出的一种放射增敏剂，根据这样的特性，在该领域研究的早期阶段也常常寻找一些具有相同特征和相似功能的小分子化合物。一些以氧自由基为基础而开发的化合物显示出了临床应用前景，部分已经在临床上得到了使用。

常规放疗的治疗效果是在电离辐射作用下，由水的放射分解所产生自由基的间接作用来实现的，然后是生物体的破坏。而由自由基引起的生物分子病变可以通过还原剂来修复，例如含有巯基的谷胱甘肽(GSH)，它是一种中和细胞内自由基的供电子基团。如果存在氧气，它将增强损伤并提高RT的效率，而氧模拟物(主要是含硝基化合物)具有电子亲和力，能够以类似于氧的方式固定自由基引起的生物分子损伤。在大多数常见类型的实体瘤，包括结直肠肿瘤中发现的低氧区域大大限制了RT的作用。因此，在结直肠癌的放射治疗中，氧气及其模拟物可以用作放射增敏剂[16]。

电子亲和放射增敏剂的原型是硝基苯，其后研究重点转向硝基咪唑，并发现或合成了大量的衍生物[17]。已知和最早开发的化合物是米索硝唑，这是一种2-硝基咪唑，对几乎所有固体小鼠肿瘤都具有放射增敏作用。

2.2 靶向缺氧细胞 由于在大多数实体瘤中可出现缺氧区域，而缺氧肿瘤细胞通常表现出放射抗性，因此，缺氧细胞是用于改善对电离辐射响应有吸引力的肿瘤特异性靶标。有研究检测活性氧供体双氢青蒿素(DHA)在常氧和严重缺氧中人结肠癌细胞系中的抗肿瘤活性。DHA有效降低常氧和缺氧条件下HCT116细胞的克隆形成存活率，但两种条件下DHA所诱导的细胞凋亡或坏死未见明显差异。在这两种条件下，活性氧物质的产生是DHA诱导毒性的重要介质。进一步的分子分析表明，DHA介导的细胞死亡涉及不同组的促凋亡Bcl-2家族成员。 DHA在严重缺氧和常氧中均具有显著细胞毒活性，为靶向缺氧肿瘤细胞以改善癌症患者的治疗效果提供新的观点[18]。

2.3 缺氧与放疗敏感性 在缺氧状态下，可出现一种在进化上较为保守的细胞内反应，称之为细胞自噬，据报道自噬参与肿瘤对放疗的抵抗，可同时诱导肿瘤细胞出现抗辐射效应[19]。Sun等[20]对于低氧条件下结肠癌细胞自噬以及对放射敏感性影响的作用机制进行了相关研究。发现在低氧条件下缺氧诱导因子(HIF-1α)和miR-210的表达显著增加，而抑制 HIF-1α的表达后也降低了miR-210的表达和自噬。 miR-210的沉默上调了Bcl-2的表达，并降低了放疗后结肠癌细胞的存活分数。在缺氧条件下，HIF-1α可诱导miRNA-210，从而增强自噬并通过下调结肠癌细胞中Bcl-2的表达来降低放射敏感性。

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境的主要成分，对肿瘤生长、浸润和转移过程至关重要，并有助于耐药性的产生。有研究调查了TAMs自噬调节对结直肠癌细胞放射敏感性的影响，在与LoVo结直肠腺癌细胞共培养期间，通过刺激TAM促进或抑制自噬。对细胞进行照射后测量LoVo集落形成和细胞凋亡，发现TAMs中自噬的上调抑制了结肠癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡，并改变了放射敏感性相关蛋白的表达。研究表明结肠直肠癌细胞的放射敏感性与TAM的自噬有关，并且刺激TAM自噬可以增加结直肠癌细胞的放射敏感性[21]。

3 DNA修复途径

研究发现与细胞DNA修复有关的多种信号途径可能影响RT的有效性。因而调控这些重要途径的化学物质，如DNA修复抑制剂对放疗可以起到增强效应。已发现多种信号通路与放射敏感性相关，如HDAC4，c-MET-PI3K-Akt、PI3K-Akt-mTOR等[22-24]。而BEZ235是一种双重PI3K-mTOR抑制剂，可增强结直肠癌细胞的放射敏感性[25]。

3.1 抑制损伤修复蛋白

3.1.1 蛋白酶抑制剂： 胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase,TS)参与体内DNA生物合成所需的胸腺嘧啶核苷酸的起始合成过程, 是该过程的限速酶。临床上用于靶向胸苷酸合成酶(TS)的化学治疗药物包括氟嘧啶(FPs)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和5-氟-2'-脱氧尿苷(FdUrd)。含有5-FU的放化疗治疗方案已被证明可改善食管癌和胃肠癌等肿瘤的局部控制，并被认为是胃肠肿瘤的标准治疗方法之一。

研究对使用慢病毒递送的shRNA和FdUrd所介导的TS失活在HCT116和HT29两种结肠癌细胞系中的细胞毒性、放射增敏和检查点激活等分别进行比较，发现TS shRNA产生的细胞毒性低于FdUrd，但对放射增敏肿瘤细胞同样有效。因此，FdUrd对TS单独的抑制作用足以引起FdUrd的放射增敏作用，研究支持TS抑制可作为一种新型放射增敏策略而进一步探索[26]。

有学者对5-FU联合甲氧胺(Mx)对人结肠癌细胞系在经γ射线处理后所引起的细胞毒作用和DNA损伤的影响进行了实验研究。首先给予1 mmol/L浓度的Mx联合5-FU处理细胞，未见其在细胞毒性和DNA损伤方面有显著影响。然而，当与2 Gy γ射线联合使用时，不同浓度5-FU对细胞的毒性作用得到加强。细胞毒性和DNA损伤随着5-FU药物浓度的增加而增加，由此提出Mx联合5-FU可增强结肠癌细胞的放射敏感性[27]。为了使5-氟尿嘧啶对放射增敏的作用达到最大化，通常认为5-FU必须长期和低剂量给药。Valdes[28]针对人结肠癌细胞系HCT-116 设计了细胞实验，将5-FU以低剂量慢性(LDC)和高剂量脉冲(HDP)2种方式分别给药，发现在HDP方式下给予5-FU与当前常用的LDC给药模式相比具有更强的放射增敏效应，HDP 5-FU给药对于高放射抵抗性的HCT-116细胞具有放射增敏作用。 此外还发现如果细胞在HDP 5-FU暴露后立即用2 Gy预照射，由于后续照射的亚致死损伤修复能力下降，这种放射增敏作用持续时间≥24 h。这表明高剂量脉冲注射5-FU与分次放射治疗的联合方案为比较理想的组合，对于临床用药方面具有较强的指导意义。

环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成的限速酶，环氧合酶-2(COX-2)作为一种炎性介质，其活性与正常组织中ROS产生及炎性信号相关。COX-2的过表达在肿瘤的发生、侵袭、转移中扮演着重要的角色[29]，在电离辐射中，可通过旁观者效应的现象进一步放大辐射细胞以及相邻细胞的辐射毒性。此外，在肿瘤中该酶的活化可以增加恶性细胞对放射疗法的抗性。因此，已经提出抑制COX-2以获得更好的治疗反应，COX-2抑制剂塞来昔布是用于放射增敏和辐射防护研究最多的COX-2抑制剂之一[30]。在人结肠癌细胞HCT116中未检测到COX-2的表达，研究发现用塞来昔布治疗显著增加COX-2阴性HCT116细胞中的BCCIP(BRCA2和CDKN1A相互作用蛋白)表达。 BCCIP的敲除明显消除了塞来昔布诱导的HCT116细胞增强的放射敏感性。塞来昔布与放射治疗联合处理细胞，可诱导更高水平的放射损伤相关蛋白磷酸化，G2/M停滞以及细胞凋亡而增强HCT116细胞的放射敏感性。塞来昔布通过上调BCCIP的表达影响p53的功能并抑制辐射诱导的损伤恢复[31]。

3.1.2 蛋白激酶抑制剂： 一些蛋白激酶抑制剂被开发出来用于特异性靶向抑制参与细胞损伤修复途径的蛋白质，从而使癌细胞对辐射敏感。蛋白激酶是催化蛋白质磷酸化的一组结构各不相同的酶，在基因表达的调节中起着关键的作用。蛋白激酶抑制剂根据抑制蛋白激酶的种类分为丝/苏氨酸蛋白激酶抑制剂和酪氨酸蛋白激酶抑制剂。

在人类细胞中，有2种主要途径负责DSB修复;第一种是非同源末端连接(NHEJ)重新连接DNA断端，这种修复机制是由DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)复合物诱导的；第二种是同源重组(HR)，其中使用完整的同源DNA序列来精确修复DSB[32]。特异性靶向抑制参与这些修复途径的蛋白质，由于抑制了细胞的修复机制而使癌细胞对辐射的敏感性增加。这不但增强了放射治疗效果，还可以使照射剂量最小化，在治疗效果最大化的同时让放射不良反应降到最低。最近，吡喃酮NU7026和色酮NU7441已被开发为特异性DNA-PK抑制剂并且正处于临床前试验[33]。近来的研究发现2种新型苯并恶嗪衍生物LTU27和LTU11B具有放射增敏作用。已显示LTU27对LY294002和NU7026具有与DNA-PK抑制剂相当的抑制效力，而LTU11B的DNA-PK抑制IC50高出一个数量级[34]。研究测试了这些化合物在结直肠腺癌细胞HT29中的放射增敏作用，结果发现这些化合物通过抑制DNA-PK导致延迟的DNA修复和促进细胞凋亡，具有强效放射增敏效应[35]。

酪氨酸激酶抑制剂博苏替尼可通过调节DNA损伤检查点提高肿瘤细胞的药物敏感性。有研究将博苏替尼与放疗结合来处理人类结肠癌细胞系HT-29，通过克隆形成法测定细胞存活的数据表明，博苏替尼可以提高HT-29细胞对放射治疗的敏感性，但需进一步量化博苏替尼的放射增敏作用[36]。

索拉非尼(Nexavar，BAY43-9006)是一种口服多激酶抑制剂，可阻断肿瘤细胞增殖和血管生成，并通过抑制丝氨酸/苏氨酸激酶诱导肿瘤细胞凋亡，研究者将3种人类结肠直肠腺癌细胞系(HCT116、HT29和SW480)单独用索拉非尼以及辐射后用索拉非尼进行治疗进行了对比研究。证实索拉非尼增强了辐射的抗增殖作用，减少了集落形成，增加了肿瘤细胞在G2/M期阻滞并增强了活性氧辐射诱导的细胞凋亡。索拉非尼还通过阻断DNA依赖性蛋白激酶激活抑制辐射所诱导的DNA损伤修复。联合治疗显著抑制体外肿瘤细胞迁移，肿瘤细胞侵袭和血管内皮生长因子介导的血管生成[37-38]。

3.2 DNA修复的表观遗传调控 基因表达的表观遗传调节不包括基因扩增、突变等DNA序列的变化，其调控可逆，通常由DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等机制介导。肿瘤细胞中影响细胞死亡和存活信号传导的表观遗传改变可以使肿瘤细胞逃脱分子靶向药物及电离辐射等所导致的细胞毒性作用[39]。因此，通过对这些基因的表观遗传调控过程进行抑制，可以调节肿瘤细胞对放射治疗的应答反应，为放疗增敏剂的发展提供了不同的策略。

3.2.1 DNA甲基化： DNA甲基化是参与调节癌细胞中基因表达调节的关键表观遗传过程，抑制DNA的甲基化可能是有效的癌症治疗策略。DNA甲基化引起的基因表达改变会影响放射治疗的应答性，由此推断DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-dC)可能对肿瘤细胞的放射敏感性产生影响。有研究对结肠癌细胞HCT116分别给予单独的照射治疗，单独5-aza-dC治疗以及用5-aza-dC与照射治疗组合处理，可见组合处理方式显著降低了肿瘤细胞的生长活性。与单独处理相比，当用放射联合5-aza-dC处理细胞时，处于G1期中HCT116细胞的百分比和其凋亡率增加，表明5-aza-dC增强结肠癌细胞的放射敏感性，与放疗联合有可能成为治疗结肠癌的临床策略[39]。

3.2.2 组蛋白修饰： 组蛋白去乙酰化酶(HDAC)从赖氨酸残基中去除乙酰基，导致染色质浓缩和基因的转录失活[40]。HDAC抑制剂现已被开发作为癌症或癌症的辅助治疗。曲古抑菌素A(TSA)是一种经典的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)，能特异性抑制HDAC的生化功能，并被证明是一种有效的抗癌药物。近来还发现TSA可在结肠癌细胞中诱导自噬反应，而自噬抑制导致细胞凋亡并增强结肠癌细胞的放射敏感性。此外，研究数据表明TSA还抑制细胞保护性自噬而使癌细胞对辐射敏感[41]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸在临床上通常被用作抗惊厥药物和情绪稳定药物。然而，丙戊酸也被证明在照射后抑制HDAC酶活性并增强肿瘤细胞的放射毒性[42-43]。该抑制剂可增加P53缺失结肠癌HCT116细胞中肿瘤抑制蛋白P21蛋白的表达以及激活检查点激酶2(CHK2)的活性水平，其放射增敏作用主要取决于CHK2的活性[44]。

4 联合方案

为避免结肠癌治疗过程中局部复发，常给予术前或术后额外放疗。然而，放疗主要是针对恶性肿瘤细胞，需要在增加恶性细胞放射敏感性的同时又不影响正常细胞的活性。在这种情况下，添加2种或2种以上的化学治疗药物作为放射增敏剂是放射生物学中的常见做法[45]。BI-69A11是一种ATP竞争性Akt抑制剂[46]，可通过抑制Akt磷酸化导致Akt-Hsp90的解离，从而导致结肠癌的细胞凋亡。最近的研究还表明，BI-69A11的抗肿瘤功效来自NF-κB和Akt通路的双重靶向作用[47]。早期的BI-69A11在结肠癌中显示出潜在的细胞凋亡诱导作用。而BI-69A11和塞来昔布组合使用，可抑制共济失调毛细血管扩张症(ATM)激酶以及负责电离辐射(IR)所诱导双链断裂(DSB)的修复基因DNA-PK的磷酸化。2种化合物的组合作用抑制了IR诱导的Akt和ATM下游靶标的激活，减弱了IR诱导的G2/M细胞周期阻滞。在调节促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的三联疗法治疗后，这可能导致细胞凋亡途径的诱导活化[45]。研究揭示了三联疗法在预防放射抗性方面的治疗潜力。

5 放射增敏剂的其他进展

目前批准用于临床的化疗药物的使用已经使化学放射疗法成为一个有吸引力的方向，并创造多种方案，有助于抗肿瘤作用。其他类型的化学放射增敏剂，如假底物，影响细胞信号传导的化学物质，靶向递送系统以及抑制放射防护物质的化学物质等，也取得了一些进展，一些正处于临床前评估阶段。此外，随着纳米技术的发展，为理想的放射增敏剂的研究和开发提供了新的机会。凭借先进的合成方法，低细胞毒性，良好的生物相容性和易于功能化，出现了一些具有良好放射增敏效应和代谢特性的纳米材料。此外，药物递送的新方法也可以改善放射增敏剂的功效[48]，可利用纳米材料的载药能力开发新的药物递送系统。生物技术药物，如miRNA，新的途径和新的放射增敏方案已被不断发现。所有这些进步拓宽了这一领域的视野，并促进了放射增敏剂的开发应用[49-50]。总之，对于放射敏感性机制的不断深入研究将为新型放射增敏剂提供靶点，跨学科研究将开发多靶点放射增敏剂或药物组合，有望加速更多新型放射增敏剂的开发应用。