金黄色葡萄球菌在儿童腹泻病人中的检出及致病性分析

赵志鹏,李晓晨，李润青，杨晓欢，赵秀英

(清华大学附属北京清华长庚医院 检验医学科，北京102218)

金黄色葡萄球菌(Sau)是自然界中分布最广的细菌之一，可引起多种组织、器官感染，是重要的致病菌之一，但一般认为Sau不是腹泻的直接致病菌。在寻找腹泻的病原学证据中，常规便培养仅限于沙门金属、志贺菌属的分离培养，Sau往往被忽视。本研究分析了本院近3年儿童粪便标本中Sau的检出情况，分别对比成人腹泻粪便标本检出情况、并且对全部Sau菌进行肠毒素(SEs)检测，发现儿科粪便标本的Sau检出率远高于成人，进一步对儿科粪便标本分离出的Sau进行了SEs和ses检测，发现这些Sau具有高表达SEs和高携带ses的特点，因此儿童腹泻病人中Sau应该引起足够重视。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2015年1月到2018年8月来北京清华长庚医院门、急诊就诊的腹泻病人并且进行粪便培养的病例总共2017例(其中成人1682例，儿童335例)，对儿童腹泻病人粪便标本中分离出的Sau进行肠毒素研究。

1.2 细菌培养与鉴定

粪便标本接种于血平板、SS平板或庆大平板(梅里埃)，可疑菌落使用全自动微生物分析仪(梅里埃VITEK-Ⅱ Compact)进行鉴定和药敏。培养结果按照弧菌属、单胞菌属、沙门菌属、志贺菌属、难辨梭菌、金黄色葡萄球菌、其他菌属进行分类统计。

1.3 肠毒素检测

使用酶联免疫荧光法检测金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)(梅里埃mini-VlDAS 免疫分析仪)。分离菌株接种于Thio液体培养基，培养12 h离心，取上清用于SEs检测，按照试剂说明书所标注，结果≥0.13判断为阳性，<0.13判断为阴性。

1.4 PCR法检测毒素基因

PCR法检测SEA-SEE五种最常见肠毒素的基因。94℃预处理5 min，94℃变性2 min,57℃退火2 min，72℃延伸1 min，35个循环[1]。引物序列见表1。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

表1 肠毒素引物序列[1]

2 结果

2.1 儿童和成人检出菌种分析

儿童腹泻标本335例，细菌培养检出Sau 17例(5.07%)、沙门菌属14例(3.58%)和假单胞菌菌属5例(1.49%)。成人腹泻标本1682例，细菌培养检出弧菌属116例(6.90%)、单胞菌属28例(1.66%)、沙门菌属25例(1.49%)、志贺菌属7例(0.42%)、难辨梭菌5例(0.30%)、金黄色葡萄球菌3例(0.18%)和其他21例(1.25%),如表2。

表2 儿童及成人 门急诊腹泻患者便培养结果

2.2 儿童腹泻标本Sau产肠毒素结果

17例儿童粪便标本中分离的Sau有10例(58.85%)肠毒素检测阳性，7例(41.18%)肠毒素检测阴性，儿童腹泻标本Sau产肠毒素率为58.85%。

2.3 儿童腹泻标本Sau肠毒素基因检测结果

17例儿童粪便标本中分离的Sau样本中10例携带肠毒素基因，其中一例同时携带sec和sed,一例同时携带seb和see，一例毒素阳性而基因检测阴性，两例毒素阴性而基因检测阳性，肠毒素基因携带和肠毒素表达情况见表3。

表3 肠毒素基因和毒素表达检测汇总表

3 讨论

肠道菌群的复杂性决定了感染性腹泻病人寻找病原学证据的困难性， Sau是环境中存在较为广泛的细菌之一，Johns Hopkins School的一项研究显示在抽检的24间卧室的尘土中12间培养出了Sau(50%)，应用定量PCR技术检出率更高[2]。加利福尼亚51963份生牛奶样本中Sau检出率为25.3%[3]，在伊拉克食物处理者的鼻咽部30.1%能够分离出Sau，其中38%为产肠毒素株[4]。在我国Sau产生肠毒素污染食物也较常见[5-7]，尤其牛奶及奶制品，中国黑龙江省400份儿生牛奶样本中Sau检出率高达83.5%[8],Sau与腹泻的关系研究最受重视的两个方面是抗生素相关性伪膜性肠炎和食物中毒性腹泻，而门急诊腹泻病人Sau检测一般不作为常规筛查项目。

本研究发现儿童腹泻病人粪便标本中检出的病原谱与成人有显著差异，成人以弧菌属、单胞菌属检出率较高，而儿童则以 Sau检出率最高。王芳健[9]分析山东地区婴幼儿腹泻病例Sau占全部检出病原菌的5.1%，严银燕[10]等对浙江省腹泻儿童病原学分析指出Sau占全部检出病原菌的23.4%。分析原因，成人和儿童的饮食谱存在差异，儿童有更多机会摄入奶、奶制品、蛋类、肉罐头等，而这些食物是常见的易被Sau或其毒素污染的食物，本实验室观察的17例Sau培养阳性的儿童有12人为3岁到4岁，此年龄段儿童正是摄入此类食品较多的年龄段，且此年龄段儿童从母体获得的免疫力已经降低，自身免疫力又未充分建立，这可能是此年龄段儿童Sau感染引起腹泻高发的原因。环境中的Sau耐药率与粪便分离Sau耐药率一致也间接证明了粪便中的Sau来源于环境的可能性大。

Sau引起腹泻的毒力因子为肠毒素(SEs)，将有明确致呕吐作用的命名为肠毒素(SEs)，没有或致呕吐作用尚有待确证的命名为肠毒素样毒力因子(SEls),目前发现的SEs和SEls有二十一种。本研究研究了SEa-SEe五种最常见的肠毒素，发现经粪便培养出的sau产肠毒素率为58.85%，与汪永禄等[11]报道的产肠毒素率为50%接近。

综上，婴幼儿腹泻患者中Sau培养阳性率高，且分离得到的菌株产肠毒素率高，因此对于婴幼儿的腹泻病例建议便培养时增加对Sau的筛查，直接检测粪便中的肠毒素也是提高腹泻患者病因精准诊断的方法和保障。但本研究研究例数较少，而且缺乏环境(母亲、辅食、居住环境)中Sau的研究，因此对sau的感染途径尚需要进一步研究和探讨。