烯醇化酶在微生物中的研究进展

彭昱萱

（西安交通大学附属中学航天学校 陕西西安 710100）

烯醇化酶(enolase, 2-phospho-D-glycerate-hydrolyase)是催化2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸，在糖酵解过程中起着重要作用，并广泛存在于不同的生物体中[1]。烯醇化酶在1934首次由Lohman和Mayerhof两位科学家在肌肉提取物中发现[2]。烯醇化酶又称D-2-磷酸-甘油盐水解酶，主要起催化作用，在糖异生途径中催化逆向反应烯醇化酶[3]。烯醇化酶广泛存在于真核和原核生物细胞中，并具有高度保守性。

在脊椎动物中，烯醇化酶α、β、γ有三种形式的同功酶。其中，我们发现α-ENO存在于肾、肝等组织中。因此，α-ENO为非神经系统的烯醇化酶(NNE)；β-ENO主要存在于心肌和骨骼肌中，在脊椎动物中又称为肌肉特异性烯醇化酶；γ-ENO主要存在于神经元和神经内分泌组织中，又称为神经元烯醇化酶(neuralenolase)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase, NSE)。α-ENO、β-ENO、γ-ENO由3种不同的基因所编码，其氨基酸序列具有高度保守性，活性形式为二聚体，由两个亚基组成。目前，我们已知有5种形式的组合：αα、ββ、γγ、αβ、αγ，在烯醇化酶脊柱动物中常以二聚体的形式存在，而原核生物中多以八聚体形式存在，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）[4,5]。

烯醇化酶作为一种多功能蛋白，存在于多种病原生物体表面或分泌物中，能参与到外界环境并与之发生作用。烯醇化酶在糖酵解过程中可以通过调节细胞生产能量的过程来保证细胞ATP水平、细胞的存活、细胞生理功能的执行。烯醇化酶还可作为自身抗原参与机体免疫反应，如引发类风湿性关节炎等慢性炎症反应。同时，烯醇化酶在脊椎动物中还能参与各种侵染，主要原因是因为烯醇化酶能与血纤维溶酶原（plasminogen）结合，可以将纤维蛋白溶酶原结合在细胞周围促使活化，发挥蛋白水解酶的作用激活纤溶酶，参与胞外基质重塑的生理及病理过程，并引发一系列下游反应[6]。

一、白念珠菌烯醇化酶

（一）白色念珠菌烯醇化酶的特征

我们在微生物领域对白色念珠菌烯醇化酶的研究起步较晚，但这些年在这方面研究的进展速度很快。白色念珠菌烯醇化酶的结构特征、理化性质也逐步被解析。烯醇化酶是白念珠菌细胞壁与细胞浆中的一种糖酵解酶，并存在于白念珠菌胞壁与胞浆中的一种糖酵解代谢关键酶，在白色念珠菌感染期间大量分泌。体外实验发现，烯醇化酶是白色念珠菌中含量丰富的蛋白质之一[7]。分析白念珠菌烯醇化酶的氨基酸序列可知，其大约由440个氨基酸组成，和酿酒酵母及哺乳动物中烯醇化酶组成相近(分别由436和433个氨基酸组成)，分子量大约45KD-48KD之间(不同环境有差异)，据计算分别占白念珠菌酵母相和菌丝总蛋白量的0.7%和2%[8]。Ishiguro等通过纯化出白念珠菌烯醇化酶活性为4262U/mg，比酿酒酵母烯醇化酶活性约高出10倍左右。酿酒酵母烯醇化酶和白念珠菌烯醇化酶一样都不含有碳水化合物部分。

Sundstrom[9]等从白念珠菌cDNA文库中对烯醇化酶基因进行分离并测序，分子量为14Kb，同时表明烯醇化酶基因是一个含有1320bp连续阅读框的片段，编码440个氨基酸蛋白与酿酒酵母细胞，编码的Eno1和Eno2分别有78%和76%的同源性，与人类细胞的α、β烯醇化酶的相似性分别为65.1%和65.5%。酶蛋白的α螺旋、β片层及β转角区域的结构有很强的保守性。除竣基端16个氨基酸外，白念珠菌和酿酒酵母烯醇化酶的一级结构很接近。

此外，我们通过研磨硫酸铵沉淀以及色谱等步骤将烯醇化酶分离和纯化，发现它的相对分子质量约是46000～48000，且烯醇化酶在pH＝6.8时的活性最强，而Mg2+则是烯醇化酶最有效的活化剂[10]。

（二）白色念珠菌烯醇化酶与疾病的发生

白念珠菌通过未知的机制将烯醇化酶送至细胞表面，在细胞表面的烯醇化酶可以激活宿主的纤溶系统，发挥血纤溶酶原受体的作用，与血纤溶酶原相结合，切除N端部分序列，使其转化为有丝氨酸蛋白酶活性的血纤溶酶，发挥蛋白质水解酶的作用，降解纤维蛋白和细胞外的基质。利用宿主自身系统破坏屏障，便于入侵与扩散[11]。目前，烯醇化酶与血纤溶酶原的结合有两种方式：一是烯醇化酶通过它的氨基酸序列C端的赖氨酸与血纤溶酶原结合，如A型链球菌的烯醇化酶只在末端是两个赖氨酸的条件下才与血纤溶酶原相结合；另一种则是以烯醇化酶肽链中部一段结构域和血纤溶酶原结合。除了影响宿主纤溶系统以外，也有部分烯醇化酶用免疫抑制的方式来侵染宿主，如龋齿链球菌表面烯醇化酶可以抑制针对T细胞依赖性抗原的免疫反应，同时诱导宿主产生白介素10协助侵染[12]。

二、金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)属于微球菌科葡萄球菌属，排列是葡萄球形，直径0.8μm左右，致病性葡萄球菌菌体较小，革兰阳性球菌，无鞭毛、芽孢，多数无荚膜，是一种广泛分布于自然界中条件性人畜共患病原菌[12]。金黄色葡萄球菌还易导致食品受污染，是一种重要的食源性致病菌[13]，也是临床上重要的革兰阳性致病菌，可以造成皮肤、软组织感染以及心内膜炎等多种疾病[14]。金黄色葡萄球菌还是导致术后伤口感染和呼吸道相关性肺炎等疾病的重要原因[15]。

金黄色葡萄球菌烯醇化酶作用机制：金黄色葡萄球菌可以利用宿主的纤溶系统侵入宿主体内。烯醇化酶通过可识别纤溶酶原受体C末端的赖氨酸残基和其受体结合后生成纤溶酶。然而，纤溶酶原仅识别赖氨酸或赖氨酸类似物[16]。生成的纤溶酶不仅发挥纤溶作用，而且可以协助病菌穿越组织屏障，进而帮助细菌侵染不同生物组织系统[17]。金黄色葡萄球菌表面的纤溶酶可以协助其破坏宿主的细胞外基质，穿透基底膜，在宿主内快速扩散[15]。

金黄色葡萄球菌中enolase与细胞外基质的一种主要成分层粘连蛋白Laminin有相互作用，发现金黄色葡萄球菌表面有一种蛋白能够与Laminin相结合，然后用单克隆抗体筛选出与Laminin相互作用的蛋白序列，通过比较发现与enolase完全重合。金黄色葡萄球菌表面的这种蛋白的单克隆抗体也能够识别酵母的α-enolase。此外，在Laminin包被培养过程中，单克隆抗体的加入会抑制金黄色葡萄球菌对培养板的粘着，这证明对enolase的抑制会影响金黄色葡萄球菌和Laminin的结合[18]。

三、支原体的相关介绍

支原体(Mycoplamsa)又称霉形体，归属于柔膜体纲 (Mollicutes)，共有6个属，120个种别[19]。支原体最早发现于1898年，1956年Robinson L B等[20]首次从细胞培养物中分离出支原体。它们广泛存在于自然界中，有80余种。支原体不具有细胞壁结构。绝大多数支原体的生长必须寄生于宿主细胞表面并具有严格的宿主选择特异性。支原体缺乏呼吸系统，而且三羧酸循环不完整，不会产生细胞色素，同时不会有高效的氧化磷酸化产生ATP的方式，仅能产生低水平的ATP。因此，支原体的主要能量来源是糖酵解途径。大量定位于支原体外的糖酵解酶在细胞代谢的过程中可以及时捕捉细胞外的葡萄糖。

支原体烯醇化酶：支原体的黏附决定着毒力。烯醇化酶在细菌中是一种毒素。它定位于细胞外，具有与血纤溶酶原或纤连蛋白结合的能力。支原体表面的烯醇化酶蛋白均能结合血纤溶酶原，从而发现烯醇化酶与细菌的黏附、定植、侵袭及其在组织中穿梭等生理过程有着极为密切的关系。在哺乳动物中，这种相互作用使细胞外基质降解，有助于细菌在组织间的穿梭和转移。宿主产生的抗细菌的烯醇化酶抗体可以与自身的烯醇化酶发生反应，在加速组织损坏的同时也加剧炎症反应，引发关节炎等自身免疫性疾病支原体的黏附决定了支原体的毒力定植的开始和关键点。我们在牛支原体 7 群中亦发现烯醇化酶是血纤溶酶原结合蛋白[21]。

四、总结与展望

烯醇化酶是一种多功能蛋白，广泛存在于各类生物体中。它是糖酵解过程中一种至关重要的酶，也可以作为自身抗原参与机体免疫反应。不仅如此，烯醇化酶还可以作为纤维蛋白溶酶原受体参与纤溶过程。在病原菌表面的烯醇化酶可以发挥蛋白质水解酶的作用，降解纤维蛋白和细胞外的基质，利用宿主自身系统破坏屏障，以便侵染与扩散。除了影响宿主纤溶系统外，也有部分烯醇化酶用免疫抑制的方式来侵染宿主。烯醇化酶除了参与病原菌侵染宿主的过程外，还是诊断学研究的靶分子。同时，烯醇化酶疫苗毒副作用小且具有靶向选择性。这些性质会为病菌感染治疗和预防提供条件。烯醇化酶还能结合现有的病菌诊断方法，成为临床辅助诊断的依据。