中药诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的研究进展※

药晓雨 任艳玲

(辽宁中医药大学研究生院2019级硕士研究生，辽宁 沈阳 110847)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种累及多脏腑，并在多种因素长期、共同作用下，以骨代谢异常、骨量低下、骨结构损坏、骨强度受损为特征的慢性全身代谢性疾病。中医传统文献中无OP病名，根据主要症状将其归为骨痿、骨枯、骨极、骨痹、腰痛等范畴。随着人口老龄化日趋严重，我国50岁以上OP导致的骨折率为19.2%，且随年龄增加其发生率上升[1]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，与OP关系最为密切的是其分化为成骨细胞和成脂细胞，并且BMSCs成骨分化和成脂分化在正常机体中处于“消长平衡”。这种“消长平衡”的打破与OP关系密切，即BMSCs分化失衡，成骨细胞减少，成脂细胞增加。兹将中药抑制BMSCs成脂分化的研究进展综述如下。

1 BMSCs成脂分化与OP的关系

OP是一类骨量降低、骨结构破坏、骨强度受损且易发生骨折的全身性疾病，以原发性骨质疏松症(primary osteoporosis，POP)多见。POP又分为老年性骨质疏松症(senile osteoporosis，SOP)和绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)。PMOP的发病与脂代谢密切相关，与脂代谢相关的临床指标是总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。王筱菁等[2]研究表明，绝经后女性的TC、TG、LDL-C均明显升高。因此，绝经后女性血脂含量增加进而BMSCs成脂分化增多。张添昊[3]研究发现，脂肪的代谢障碍会导致骨髓微循环障碍，使骨代谢能力下降和骨量丢失。脂肪酸能促使成骨细胞转化为成脂细胞，同时调节BMSCs分化的转录因子和信号传导方式。SOP是由于进入老年，机体BMSCs向成骨分化受到抑制且成骨分裂增殖变缓，成骨效率下降，同时成脂分化成熟且骨吸收活性相对活跃，导致OP的发生。因此，在正常机体状态下成骨分化和成脂分化处于平衡，机体健康。若受内分泌、年龄等因素影响则BMSCs成脂分化能力增加，成骨能力逐渐减弱，导致骨髓内细胞分化异常，骨代谢异常，出现OP。

2 BMSCs成脂分化的形成机制

首先，BMSCs成脂分化的诱导是细胞P3代完全汇合后加入含有一定浓度的3-异丁基-1甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、胎牛血清等制成诱导液，进行BMSCs成脂诱导[4]。可通过显微镜和油红O脂肪染色观察脂滴形态及分化程度。徐道华[5]研究表明，正常胎牛血清体积分数在0.05和0.1时，成脂分化结果较好。但当胎牛血清体积分数增加到0.2时对BMSCs成脂分化具有抑制作用。其次，BMSCs成脂分化与信号通路息息相关。如Wnt信号通路、转化生长因子β1(TGF-β1)信号通路。其中Wnt信号通路是一个蛋白质作用网络，参与许多生物过程。此外，Wnt信号通路可增强成骨分化，抑制成脂分化[6]。Shuai Yi等[7]研究发现，微小RNA(miR)参与调节了BMSCs异常的成脂分化，其中miR-199a-3p通过Wnt信号通路调节脂肪形成；miR-199a-3p可通过降低赖氨酸去甲基化酶6A(KDM6A)基因表达，以减少miR-199a-3p激活过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPAR-γ)和脂肪酸结合蛋白(ap2)基因，进而抑制BMSCs成脂分化。周鑫等[8]研究表明，Wnt信号通路在CD31-/CD34+/CD146+的脂肪细胞有较强活性，因此CD31-/CD34+/CD146+成脂能力弱，成骨能力强。李清江[9]研究表明，Wnt10b是Wnt信号通路的组成因子之一。Wnt10b基因高表达能对人BMSCs成骨分化起促进作用、成脂分化起抑制作用。在经典的Wnt信号通路中，过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)是其中的转录因子，PPAR中的PPAR-γ是该家族的亚型之一，控制许多细胞的代谢过程。有研究认为，PPAR-γ是BMSCs分化中脂肪细胞的“催化剂”，而对于成骨细胞则是“抑制剂”，在经典的Wnt信号通路中通过抑制PPAR-γ因子的表达，进而抑制BMSCs成脂分化[10-11]。葛心慈等[12]实验表明，在治疗OP时药物干预的各组大鼠对BMSCs中PPAR-γ mRNA下调表达明显。转化生长因子-β(TGF-β)信号通路在成熟机体和发育中的胚胎都参与了许多细胞过程，包括细胞生长、分化、凋亡。其中TGF-β家族包括3个亚型，分别是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。何丽娟等[13]实验表明，大鼠BMSCs中的TGF-β1的阳性表达位于其细胞质中，且实验用药组均可增加BMSCs中TGF-β1蛋白表达，因此TGF-β1在BMSCs成骨分化和成脂分化中均有作用。周鑫[8]研究表明，TGF-β1家族中的骨形成蛋白与胰岛素相互作用，有利于BMSCs的成脂分化。

3 中药对BMSCs成脂分化的影响

OP与BMSCs的成脂分化关系密切，中药对BMSCs成脂分化影响较多，进而中药能够治疗OP。对于OP的治疗，历代医家在古医籍中多有描述。《内经》记载“骨痿者，补肾法治之”，李东垣《脾胃论》云“真气又名元气，乃身生之精气也，非胃气不能滋之”。治疗OP应重在补肾健脾，益气活血。

3.1 单味药或单体对BMSCs成脂分化的影响 目前单味中药或单体干预BMSCs成脂分化主要有：淫羊藿、补骨脂、石斛、骨碎补、葛根、杜仲、土鳖虫、丹参、银杏叶、红花、莱菔子、姜黄、黄芪、佩兰、白术等。刘海全等[14]取SD大鼠双侧股骨中BMSCs后，利用贴壁培养法纯化细胞，加入淫羊藿含药血清，随机将其分为低、中、高剂量组，分别为临床剂量的5、10、20倍进行成脂诱导分化。结果：与未加淫羊藿含药血清的成脂诱导组比较，加入淫羊藿含药血清低、中、高剂量组对抑制PPAR-γ mRNA表达明显，从而起到抑制BMSCs成脂分化的作用。李智奎等[15]通过淫羊藿提取物淫羊藿苷进行体外培养BMSCs，将淫羊藿苷分为10、20、30、40、50 ng/mL不同浓度，观察淫羊藿苷对BMSCs的影响。结果：3、4 d时50 ng/mL的淫羊藿苷抑制BMSCs增殖,并且对BMSCs成脂分化的重要基因PPAR-γ、降脂蛋白降脂素(Adipsin)、重组人脂肪酸结合蛋白4(FABP4)均有影响；淫羊藿苷浓度10 ng/mL时PPAR-γ、Adipsin、FABP4表达最低。因此，淫羊藿在一定用量下对BMSCs成脂分化有抑制作用。张洪跃等[16]研究表明，首先通过全骨髓贴壁法进行传代、培养，后进行诱导成脂分化。将浓度分为0～20 μmol/L梯式增加的5组。油红O脂肪染色发现，与空白组比较，在补骨脂素诱导下的BMSCs成脂分化各组油红O脂肪染色阳性对照率均降低，且随着浓度的增加阳性对照率逐渐降低。异补骨脂素是补骨脂素的同源异构体，有学者研究发现异补骨脂素也具有抑制BMSCs成脂分化的作用。王剑[17]通过油红O脂肪染色实验发现，异补骨脂素加药处理的成脂诱导7 d后，观察脂肪包浆中所含脂滴含量下降；通过蛋白印迹(Western Blot)实验发现，成脂分化的关键转录因子PPAR-γ在小鼠BMSCs中的表达显著降低，且在浓度为20 μmol/L表达最明显。徐路加[18]对P3代BMSCs成脂诱导加入石斛多糖进行干预，油红O脂肪染色结果表明：10、20 d后，石斛多糖浓度在400、800 μg/mL时，被染脂滴数明显减少。李琰等[19]以骨碎补水煎液灌服去卵巢骨质疏松SD大鼠，给药12周后对其BMSCs进行成脂诱导16 d后观察脂滴形态，发现灌服骨碎补水煎液组脂滴数少，体积小；另外，取P3代BMSCs应用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测PPAR-γ、脂蛋白脂肪酶(LPL)mRNA表达，发现骨碎补水煎液组PPAR-γ mRNA、LPL mRNA表达降低。因此，骨碎补水煎液能激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制PPAR-γ mRNA、LPL mRNA的表达，抑制BMSCs成脂分化。齐振熙等[20]用葛根素干预BMSCs 6 d，用实时荧光定量PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路主要成员Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA、β-catenin mRNA的表达，发现葛根素各剂量组干预下Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA、β-catenin mRNA的蛋白表达上升。在低倍镜下观察BMSCs各组图像，葛根素各剂量组仅含有小脂滴细胞。因此，葛根素能抑制BMSCs成脂分化。张贤等[21]通过杜仲水提物及杜仲醇提物干预诱导BMSCs成脂分化15 d后，应用实时荧光定量PCR法测定PPAR-γ和ap2的表达，发现杜仲水提物和杜仲醇提物的ap2基因表达下调，PPAR-γ基因表达正常。因此，杜仲有利于抑制BMSCs成脂分化，且抑制点作用在ap2基因上。齐振熙等[22]通过在激素诱导后的BMSCs成脂细胞内加入土鳖虫含药血清干预6 d后，检测PPAR-γ和ap2基因表达结果，发现加入土鳖虫含药血清组的PPAR-γ和ap2基因表达显著下调。中药单体丹酚酸B是丹参的水溶性成分之一，丹参素是丹参的提取物。庞婷婷等[23]应用丹参素和丹酚酸B干预BMSCs成脂分化9 d后，油红O脂肪染色低倍镜下观察，可见丹参素组和丹酚酸B组的脂肪细胞明显减少。因此，丹参提取物能抑制BMSCs成脂分化，且Cui Liao等[24]研究发现在Wnt信号通路下丹酚酸能抑制BMSCs成脂分化。谷旭[25]将不同浓度的银杏叶提取物加入纯化后的P3代BMSCs中诱导成脂分化7 d，结果显示：细胞表面抗原CD44、CD105为阳性，CD34为阴性；油红O脂肪染色可见不同浓度银杏叶提取物组脂滴均减少，且随着银杏叶提取物浓度增加，脂滴数量减少；实时荧光定量PCR检测显示ap2和PPAR-γ基因表达随着浓度增加逐步降低。于涛[26]通过提取红花中有效成分羟基红花黄色素A，将其分为不同浓度加入BMSCs干预成脂诱导6 d，结果发现低倍镜下油红O脂肪染色不同浓度红花提取物脂滴均有减少；PCR检测PPAR-γ mRNA表达明显降低。莱菔子有效提取物为芥子碱。黄炜平等[27]通过低浓度过氧化氢(H2O2)诱导BMSCs成脂分化并加入芥子碱进行干预，通过Western Blot和实时荧光定量PCR法检测PPAR-γ、ap2及葡萄糖转运蛋白(Glut4)蛋白表达及基因表达，发现PPAR-γ、ap2及Glut4蛋白表达及基因表达均下降。姜黄素为姜黄的提取物。张庆美等[28]将不同浓度姜黄素加入P5代猪BMSCs中进行成脂诱导10 d，油红O脂肪染色可见随着姜黄素浓度的增加细胞成脂率逐渐下降；实时荧光定量PCR检测PPAR-γ2基因随浓度增加表达降低。黄芪多糖是黄芪的提取物之一。魏孔熙等[29]运用X线辐射法干预诱导人BMSCs向脂肪细胞转化，并加入黄芪多糖50 μg/mL后通过油红O脂肪染色和Western Blot检测进行比较。结果：油红O脂肪染色后，加入黄芪多糖的BMSCs细胞结构稍增加、细胞形态稍正常、成脂分化能力稍增强。Western Blot检测加入黄芪多糖的BMSCs细胞PPAR-γ的表达增强。伍志伟等[30]通过低、中、高不同浓度低氧环境下诱导BMSCs向脂肪细胞分化，并加入低、中、高不同剂量的黄芪多糖进行干预。通过实时荧光定量PCR和Western Blot检测细胞中PPAR-γ、LPL基因及蛋白表达。结果：与单纯低氧环境下的细胞比较，加入不同剂量黄芪多糖的PPAR-γ、LPL的基因蛋白表达均显著增加。故黄芪提取物黄芪多糖对受X线辐射条件下和低氧环境下的BMSCs成脂分化有促进作用。张洁[31]将佩兰水煎液分为低、中、高不同剂量组后灌胃高脂饮食的SD大鼠7 d，取BMSCs培养。结果：低、中、高剂量组含药血清在油红O脂肪染色实验中脂滴形态均处于抑制状态。白术内酯Ⅲ是白术单体之一。李可[32]通过H2O2和不同浓度的白术内酯Ⅲ分别干预诱导BMSCs成脂分化。结果：白术内酯Ⅲ诱导的BMSCs在油红O脂肪染色下脂滴数量和形态明显下降，实时荧光定量PCR和Western Blot检测的PPAR-γ基因和蛋白表达显著下降。

3.2 中药复方对BMSCs成脂分化的影响 杨锋等[33]通过右归丸灌胃大鼠3 d后取其血清，进行BMSCs成脂诱导分化，通过实时荧光定量PCR法和甲基化特异性PCR法检测，发现右归丸含药血清能通过去甲基化的方式抑制BMSCs成脂分化，其与BMSCs成脂分化相关的转录因子PPAR-γ基因也明显下调。李树强等[34]通过桃红四物汤低、中、高剂量干预含激素的BMSCs成脂分化6 d，发现桃红四物汤不同剂量组随着药物剂量增加，细胞内PPAR-γ、ap2表达显著下调，因此桃红四物汤能抑制BMSCs成脂分化。王芳等[35]将黄芪散(药物组成：葛根、黄芪、桑白皮)含药血清分为5%、10%、20%浓度组干预大鼠BMSCs，通过检测成脂基因ap2 mRNA样本的浓度及纯度，发现ap2 mRNA在5%浓度时表达最明显。因此，黄芪散对BMSCs成脂分化有一定的抑制作用。李远栋等[36]证明荣筋片(药物组成：牛膝、蒺藜、陈皮、杜仲、茯苓、甘草)能抑制骨组织中PPAR-γ表达，对BMSCs成脂分化具有抑制作用。刘幸明等[37]选择金匮肾气丸(药物组成：地黄、山药、山茱萸、茯苓、牡丹皮、泽泻、桂枝、制附子、牛膝、炙车前子)、健骨二仙丸(药物组成：龟版、鹿角胶、党参、枸杞子、续断、山药)、六味地黄丸(药物组成：熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻)对老化的BMSCs进行干预，实验通过氧化诱导衰老模型后，分为模型组、金匮肾气丸组、健骨二仙丸组和六味地黄丸组。结果：与模型组比较，3个治疗组均可下调与成脂分化密切相关的PPAY-γ2、C/增强子结合蛋白β(EBPβ)mRNA，其中金匮肾气丸对PPAR-γ2下调作用优于健骨二仙丸和六味地黄丸，六味地黄丸对C/EBPβ下调作用优于金匮肾气丸和健骨二仙丸。周亚娜等[38]通过补肾化痰方(药物组成：淫羊藿、补骨脂、瓜蒌、神曲、山楂)成脂诱导15 d，油红O脂肪染色结果发现化痰方(药物组成：瓜蒌、神曲、山楂)脂肪细胞数量减少，LPL mRNA的表达下调明显，因此化痰方能更好地抑制BMSCs成脂分化。徐无忌等[39]对BMSCs成脂诱导后加入骨康方(药物组成：丹参、补骨脂、淫羊藿)含药血清，发现加入骨康方的脂肪细胞转化率明显降低。李晓敏等[40]将健脾活骨方(药物组成：白术、党参、赤芍、桂枝、法半夏、茯苓、熟地黄、当归、甘草、川芎)进行不同的萃取方式，得到乙酸乙酯、正丁醇、水等萃取部位，并观察不同萃取部位对BMSCs成脂分化的影响。其中油红O脂肪染色后发现随着乙酸乙酯部位浓度的增加，红色脂滴数量逐渐减少。张志峰等[41]在诱导老年性大鼠BMSCs成脂分化中加入壮骨强筋片(药物组成：杜仲、淫羊藿、牛膝、鹿角胶、肉苁蓉、何首乌、龟版、当归、地骨皮、独活、羌活)含药血清14 d，发现加入壮骨强筋片含药血清组PPAR-γ和LPL基因表达降低，说明壮骨强筋片对BMSCs成脂分化有抑制作用。

4 结 语

综上所述，BMSCs成骨分化与成脂分化的动态平衡是维持机体骨骼系统稳定的关键，并且促进成骨分化、抑制成脂分化是治疗OP的新靶点。Wnt信号通路和TGF-β信号通路是OP发病机制和BMSCs成脂分化的重要信号通路，PPAR-γ、C/EBPβ等基因是Wnt和TGF-β信号通路中重要的转录因子。大多数学者通过提取中药中有效成分抑制成脂分化的重要因子，以达到治疗OP目的。大部分中药通过补肾健脾、温阳益气活血，调整肾阴肾阳，达到肾气平和。肾精充盈则精生髓，髓化气生血，可将现代医学中的BMSCs与中医“髓”的概念相呼应。故肾阴阳和合则髓亦充盈，BMSCs的成骨分化和成脂分化也能维持动态平衡。孙思邈《备急千金要方》云“骨极者主肾也，肾应骨，骨与肾合”，骨痹不已，感受邪气则内舍于肾，肾与骨的关系尤为密切。故补肾阴或补肾阳的淫羊藿、骨碎补、补骨脂及左归丸、右归丸、金匮肾气丸等能促进BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化。髓能化气生血，肾气充沛则瘀血去，新血生，肾气有力推动和化解机体瘀血，故土鳖虫、丹参、红花等对BMSCs的分化有一定影响。中药及其中成药防治OP，以改善患者症状、降低骨折发生风险、提高生活质量为原则，但中药所含化学成分复杂多样，提取有效成分的精确度和浓度难以把控，有待今后进一步研究。