血管性痴呆患者血清miR-17和VEGF表达及相关性

李军 李星 牛犇

(南阳市中心医院神经内科，河南 南阳 473000)

血管性痴呆(VD)是指由于进入到大脑的血流量减少，造成机体记忆、认知及行为功能障碍的进行性疾病。研究表明，脑卒中及脑缺血缺氧等均可引发VD，而吸烟、高龄、低血压患者、有家族病史者较常人更易患VD〔1〕。miR-17是微小RNA(miRNA)中的一种，能够参与细胞的增殖、凋亡等一系列生物学活动及机体免疫调节过程。血管内皮生长因子(VEGF)是一种具有高度生物活性的糖蛋白，是血管生成的关键性生物活性因子，可有效诱导血管新生，增加血管通透性〔2〕。近年来研究表明，血管性危险因素可能参与VD的疾病进程，miR-17和VEGF表达异常可能与疾病相关的调控过程异常有关〔3〕。本研究通过检测VD患者血清中miR-17和VEGF的表达情况，并探讨二者的表达关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年2月至2019年1月在南阳市中心医院就诊的87例VD患者作为观察组，男49例，女38例，年龄60～81岁，平均年龄(73.28±7.43)岁，同期选取来院参与体检的健康者65例作为对照组，男37例，女28例，年龄61～82岁，平均年龄(74.03±7.85)岁。对所有受试者采用简易智能状态检测(MMSE)量表进行评分测试，测试均由专业医师在医院心理测量室完成。其中MMSE评分在28～30分者为正常，20分≤MMSE评分<28分为轻度痴呆，10分≤MMSE评分<20分为中度痴呆，10分

VD纳入标准：①符合VD的诊断标准〔4〕；②患者MMSE评分均低于28分；③头部CT检查正常；④患者及其家属已签字确认均知情同意。排除标准：①心、脑、肝、肾功能异常者；②有自身免疫性疾病、内分泌疾病及恶性肿瘤疾病；③发病前有认知功能障碍、精神障碍及失语者；④具有成瘾性药物病史；⑤资料不全者。两组一般资料相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》，并经医院医学伦理委员会讨论，批准后进行研究。

1.2主要试剂及仪器 RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，反转录试剂盒购自Takara公司，SYBR®Green试剂盒购自北京普凯瑞生物科技有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，多功能酶标仪、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)仪购自美国Bio-Rad公司，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1样本采集与保存 于清晨空腹时采集受试者静脉血5 ml于真空干燥管中，静置30 min后，以转速3 000 r/min在4℃离心机上离心10 min，取上清立即进行试验或分装后保存于-80℃冰箱待测，样本应避免反复冻融。

1.3.2受试者血清miR-17水平测定 采用RNA提取试剂盒提取RNA，反转录得cDNA。采用定量PCR仪进行miR-17扩增。qRT-PCR采用SYBR®Green试剂盒，反应体系为10 μl，miScript SYBR®Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1 μl，上下游引物(10 μmol/L)均为0.5 μl，双蒸水(ddH2O)3.0 μl。具体步骤详见说明书，miR-17反应条件：95℃：30 s；95℃：10 s；60℃：35 s，共40个循环。

miR-17及内参U6的引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法对miR-17表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3血清VEGF水平测定 采用ELISA测定血清VEGF表达水平，在反应板孔内依次加入10 μl校准品、质控品、待测样品及100 μl酶标抗体工作液，温室摇床温育2 h后，进行洗板，之后加入100 μl的1×底物工作液，室温温育15 min，加入终止液100 μl摇匀后使用多功能酶标仪进行测定。具体操作步骤详见VEGF ELISA试剂盒说明书，为减小误差，待测样品应至少测定2次。

1.4统计学分析 利用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1两组一般资料比较 两组年龄、性别、体重指数、是否吸烟、是否饮酒等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，观察组MMSE评分显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

2.2两组血清中miR-17和VEGF水平 观察组血清miR-17和VEGF表达水平均显著低于对照组(P<0.05)。见表3。

表2 两组一般资料比较

表3 两组血清中miR-17和VEGF表达水平

2.3不同程度VD患者血清中miR-17和VEGF水平 重度组血清miR-17和VEGF表达水平均显著低于中度组和轻度组(P<0.05)；中度组血清miR-17和VEGF水平均显著低于轻度组(P<0.05)。见表4。

表4 不同程度VD患者血清中miR-17和VEGF表达水平

与轻度组比较:1)P<0.05；与中度组比较:2)P<0.05

2.4VD患者血清中miR-17和VEGF表达水平与MMSE评分的相关性 血清miR-17和VEGF水平均与VD患者MMSE评分呈正相关(r=0.731、0.703，P<0.05)。见图1。

2.5VD患者血清中miR-17与VEGF表达水平的相关性 VD患者血清miR-17与VEGF表达水平呈正相关(r=0.668，P<0.05)。见图2。

图1 VD患者血清中miR-17和VEGF表达水平与MMSE评分的相关性

图2 VD患者血清中miR-17与VEGF表达水平的相关性

3 讨 论

VD是世界上仅次于阿尔茨海默病的第二大痴呆类疾病，占痴呆患者总人数的18%左右〔5〕，VD被认为是由脑组织供血供氧不足等导致的脑功能障碍，根据发病的形式可分为急性VD和慢性VD。其临床表现为认知功能减退、记忆障碍、情感障碍、行为异常、生活自理能力及其他社会功能下降等，严重威胁患者生命健康〔1〕，诊断VD患者的痴呆程度常用的评分量表有Hachinski缺血计分表、韦氏记忆量表(WMS-CR)、日常生活功能量表(ADL)、MMSE等〔6〕，临床上这些量表可单独使用或组合使用。其中MMSE是最常使用的反映VD患者痴呆程度的评价量表。随着社会人口老龄化进程的不断加快，VD发病率呈逐年上升的趋势，给社会发展及其家庭经济带来了负担。但其具体发病机制至今仍不是很清楚。研究表明，血管病变及其他系统损害是VD发病的病因，且其发病过程与炎症反应关系密切〔7〕。另外血管内皮细胞对维持脑部内环境稳定及免疫代谢过程具有重要的作用，其代谢异常能够使脑组织神经细胞死亡及神经功能紊乱，可能参与VD的疾病进程，因此寻找能够调节血管形成的生物标志物来反映VD的疾病进程，对于临床治疗VD患者具有重要意义。miRNA广泛存在于真核生物中，能够参与早期胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡及造血调控等生理过程，是机体内重要的基因表达调控因子，与血管形成具有一定的关系〔8〕。miR-17是miRNA的一个家族，是由6个结构相仿，序列相似，物种间高度保守的成熟体miRNA组成〔9〕。研究表明，miR-17在肿瘤组织中表达异常，具有促进细胞增殖，减少细胞凋亡，诱导血管生成的作用〔10〕。Yan等〔11〕研究表明miR-17-92在结肠癌患者体内表达异常，miR-17-92簇高表达能够抑制由缺氧诱导的细胞凋亡，说明miR-17-92高表达可能在缺氧所致细胞凋亡中起重要作用。Kang等〔12〕研究表明miR-17家族是滤泡辅助性T细胞(TFH)分化的调节因子，通过抑制pH结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白质磷酸酶(PHLPP)2的表达，调节可诱导协同刺激分子(ICOS)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的信号强度来控制T细胞向B细胞滤泡的迁移，在体液免疫中具有重要的调节作用。本研究结果显示观察组miR-17表达水平显著低于对照组，与VD患者MMSE评分呈正相关，提示miR-17水平降低可能与VD发生有关。VEGF又称作血管调理素，是对血管形成具有特异性调节的生长因子，脑缺血损伤后，血管内皮细胞、神经元及胶质细胞等均可分泌VEGF，进而促进血管的生长及内皮细胞分裂〔13〕。据报道VEGF表达异常下调时可使血管修复受损，造成缺血性神经元损伤，在组织或器官生理或病理条件下，VEGF能够联系相关信号通路，参与调节血管新生过程，抑制神经细胞凋亡〔14〕。唐慧等〔15〕研究表明雌激素能够通过上调VEGF蛋白表达，降低大鼠脑慢性低灌注诱导的微血管损伤。Wang等〔16〕在VD大鼠模型中研究了骨髓单个核细胞移植对VD大鼠认知功能的影响，结果发现骨髓单个核细胞移植可通过增强血管生成，减少蛋白质损伤，促进大鼠的认知恢复。研究表明，血管生成可能是由VEGF-VEGFR2信号通路上调引起。Zhang等〔17〕探究了经颅磁刺激(rTMS)对VD大鼠学习和记忆的影响，结果表明rTMS通过上调VEGF，能够改善VD模型大鼠的学习和记忆。本研究结果显示观察组VEGF表达水平显著低于对照组，血清VEGF水平与VD患者MMSE评分呈正相关，提示VEGF水平降低可能与VD发生有关。许晓月等〔18〕研究表明miR-17-5p可能通过调控血管形成相关基因VEGF的表达进而影响子宫内膜异位症的发病。Chamorro-Jorganes等〔19〕miR-17-92簇表达可能通过诱导VEGF的分泌，促进血管内皮细胞生成，参与血管生成的调节。本研究结果提示miR-17和VEGF水平可能参与VD疾病发展进程。

综上所述，miR-17和VEGF在VD患者血清中明显下调，血清中miR-17和VEGF水平呈明显正相关，提示二者可能与血管性痴呆疾病的发生和病情发展有关。然而，本研究仅初步探究miR-17和VEGF在VD患者血清中的表达关系，具体生物学机制仍需继续深入研究。另外，本研究样本例数较少，下一步准备扩大样本容量继续进行深入研究，以期为VD患者的临床治疗提供一定参考依据。