丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏TRB3的调节作用

刘东慧 付文亮 付秀美 宋成军 陈志宏

(承德医学院人体解剖学教研室，河北 承德 067000)

肝细胞Tribbles同源蛋白(TRB)3是哺乳动物Tribbles家族中的一员，在人和鼠的肝脏中高表达〔1〕。TRB3作为胰岛素磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的负性调节因子，主要通过影响Akt来干扰葡萄糖的转运、肝糖原合成及糖异生等过程，进而引发胰岛素信号转导障碍从而导致胰岛素抵抗〔2,3〕。2型糖尿病是一种以胰岛素抵抗为主要特征的慢性代谢性疾病，目前临床的治疗仍以药物为主，各类药物虽有较好的降糖效果，但毒副作用较大，且不能有效改善胰岛素抵抗。因此，寻找一种安全有效的天然降糖药物十分必要。丝胶(蚕茧水提取物)是一种天然水溶性蛋白，民间亦有蚕茧泡水降血糖的验方。同时，本课题组在前期进行2型糖尿病的中医药防治研究工作时发现丝胶能够有效降低2型糖尿病大鼠的血糖并对肝脏具有一定的保护作用〔4,5〕，但具体作用机制尚不明确。本研究通过观察2型糖尿病大鼠肝脏TRB3蛋白和mRNA的表达来探讨丝胶降血糖的作用机制，并对一直作为缫丝废料的丝胶加以有效利用。

1 材料和方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠36只，体重170～190 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。将大鼠饲养于承德医学院实验动物房(光照时间12 h/d；温度20～24℃；相对湿度50%～55%)，自由饮水和摄食，正常对照组和造模组大鼠分别给予普通饲料和高脂高糖饲料〔6〕(基础饲料59%，白砂糖20%，蛋黄3%，猪油18%)喂养。

1.2实验主要药物与试剂 丝胶从彩色蚕茧(由承德医学院桑蚕研究所提供)中提取后干燥成粉末储存备用，灌胃前用生理盐水溶解至相应浓度；链脲佐菌素(美国Sigma公司)，临用前用柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH=4.4)配制成2%的溶液；浓缩型二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗TRB3多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；大肠杆菌DH5α感受态细胞、质粒小提试剂盒、pGM-T克隆试剂盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕；反转录试剂盒、染料法实时荧光定量试剂盒、PCR引物〔宝生物工程(大连)有限公司〕。

1.3实验动物分组及处理 将36只大鼠给予普通饲料适应性饲养1 w后随机分为正常对照组(12只)和造模组(24只)。造模组大鼠给予高脂高糖饲料喂养8 w后，连续2 d腹腔注射链脲佐菌素35 mg/(kg·d)，注射72 h后检测血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L作为2型糖尿病大鼠成模标准〔7〕。将成模的大鼠随机分为模型组和丝胶治疗组，每组12只，给予丝胶治疗组大鼠2.4 g/(kg·d)的丝胶连续灌胃35 d，给予模型组和正常对照组大鼠等体积生理盐水连续灌胃35 d。灌胃结束，将各组大鼠禁食12 h、称重、麻醉后取血离心用于检测血糖，处死后取肝脏一部分放入布安固定液固定，另一部分放入液氮保存用于检测TRB3的表达。

1.4检测大鼠血糖水平 将血液离心后分离血清，采用葡萄糖氧化酶法检测各组大鼠血糖水平。

1.5检测大鼠肝脏TRB3的表达

1.5.1检测大鼠肝脏TRB3蛋白的表达 SP免疫组织化学法：肝脏组织固定、包埋后5 μm厚连续切片。将切片脱蜡、37℃ 3%过氧化氢(H2O2)-甲醇孵育30 min、微波抗原修复后，加入一抗(浓度1∶50)4℃过夜，二抗37℃孵育30 min，DAB染色，苏木素复染肝细胞核，阳性表现为细胞质中出现棕黄色和(或)棕褐色颗粒，以磷酸盐缓冲溶液(PBS)代替一抗作为阴性对照。定量分析：每只大鼠随机选取3张非连续肝脏切片，在200倍显微镜下观察，每张切片随机选取3个视野，采用Image-ProPlus6.0软件对每个视野中阳性表达产物的积分光密度值测定3次，取平均值作为肝脏TRB3蛋白的表达量。

免疫印迹法：取100 mg液氮中保存的肝脏组织，提取总蛋白并测定浓度。取100 μg总蛋白上样，12%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转膜，封闭后一抗(浓度TRB3 1∶300，β-actin 1∶1 000)、二抗(浓度1∶5 000)室温摇床分别孵育2.0 h、1.5 h，显影后应用Quantity One-v 4.6.2软件对条带进行灰度分析，以TRB3与β-actin蛋白条带的灰度比值作为TRB3蛋白的相对表达水平。

1.5.2检测大鼠肝脏TRB3 mRNA的表达 实时定量PCR法：采用pGM-T质粒载体构建TRB3和内参GAPDH的DNA标准品用以后续定量。取100 mg肝脏组织提取总RNA，并反转录成cDNA，再利用实时定量PCR法扩增TRB3和GAPDH，以TRB3拷贝数与相应GAPDH拷贝数的比值作为各组大鼠TRB3 mRNA的相对表达水平。TRB3和GAPDH引物序列见表1。

表1 TRB3及GAPDH基因引物序列及大小

1.6统计分析 利用SPSS24.0统计学软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠血糖水平 与正常对照组相比，模型组血糖明显升高(t=12.33，P<0.05)；与模型组相比，丝胶治疗组血糖明显降低(t=-8.91，P<0.05)。见表2。

表2 各组血糖及肝脏TRB3蛋白、mRNA的表达

与模型组比较：1)P<0.05

2.2各组大鼠肝脏TRB3的表达 SP免疫组化法结果：各组大鼠肝脏切片均可见TRB3蛋白表达，表现为细胞质中的棕黄色和(或)棕褐色颗粒。见图1。免疫印迹法结果：在蛋白分子量45 kD、43 kD处可见清晰的TRB3、β-actin条带。见图2。实时定量Q-PCR结果：以各组大鼠样品cDNA和5个浓度梯度的pGM-T-TRB3阳性质粒(1.24×108～1.24×104)作为模板，经过实时定量PCR扩增，得到标准曲线(斜率=-3.160，相关系数r=-0.999，截距=32.751，扩增效率为107.233%)、扩增曲线(典型的S型)、溶解曲线(单峰)。见图3。TRB3蛋白及mRNA的定量分析结果：模型组肝脏TRB3蛋白及mRNA的表达明显高于正常对照组(tSP免疫组织化学法=5.62，t免疫印迹法=8.81，t实时定量PCR法=2.67，P<0.05)；丝胶治疗组肝脏TRB3蛋白及mRNA的表达明显低于模型组(tSP免疫组织化学法=-2.32，t免疫印迹法=-4.89，t实时定量PCR法=-3.08，P<0.05)。见表2。

图1 各组大鼠肝脏TRB3蛋白的表达(SP免疫组织化学法，×200)

1.正常对照组；2.模型组；3.丝胶治疗组图2 各组大鼠肝脏TRB3蛋白的表达(免疫印迹法)

图3 各组大鼠肝脏TRB3 mRNA的表达(实时定量PCR)

3 讨 论

肝脏是胰岛素作用的重要靶器官，胰岛素与肝细胞膜表面胰岛素受体结合后激活胰岛素受体底物，活化的胰岛素受体底物进一步激活下游的PI3K，PI3K产生第二信使3、4、5-三磷酸酯酰肌醇促使Akt磷酸化后被激活〔8,9〕。Akt活化后主要通过以下三条途径调节肝细胞内糖类代谢过程：①促进葡萄糖转运蛋白囊泡向细胞膜转运，加速将胞外的葡萄糖转运至胞内〔10,11〕；②促进糖原合成酶激酶-3介导的糖原合成〔12,13〕；③促进转录因子-过氧化物酶刺激因子受体协作子α磷酸化而抑制肝细胞糖异生〔14〕。由此可见在肝脏胰岛素PI3K/Akt信号转导通路调节糖类代谢过程中，Akt发挥了十分重要的作用。

TRB3因激酶功能区域缺乏与三磷酸腺苷(ATP)结合的位点及催化核心序列而不具有蛋白激酶的催化活性，被称为假激酶。研究发现，某些假激酶通过与未磷酸化的Akt结合抑制其活化而导致胰岛素PI3K/Akt信号传导通路障碍〔15〕，其中对TRB3的研究备受关注。Du等〔16〕发现，与正常小鼠相比，db/db糖尿病小鼠肝脏TRB3表达水平增高10～20倍，机制可能是在糖尿病状态下，胰高血糖素通过环磷酸腺苷途径激活蛋白激酶，使环磷酸腺苷反应元件结合蛋白磷酸化并与环磷酸腺苷反应元件结合，诱导过氧化物酶刺激因子受体协作子α基因表达。过氧化物酶刺激因子受体协作子α表达后通过激活过氧化物酶体增殖剂激活受体-α，使其与TRB3启动子上的过氧化物酶体增殖剂激活受体-α调节元件结合进而促进TRB3的表达。TRB3表达升高，作为假激酶与Akt结合后通过阻碍Akt 磷酸化并干扰Akt的转膜进而影响胰岛素PI3K/Akt信号的转导。

在对TRB3转基因小鼠肝脏的研究中发现，TRB3可通过抑制Akt磷酸化而降低小鼠的糖耐量，从而使血糖水平升高；而在TRB3基因敲除小鼠体内，肝细胞对胰岛素的敏感性明显提高，Akt磷酸化水平升高，血糖明显降低〔16〕。由此可见，TRB3可通过Akt影响糖尿病小鼠的血糖水平。本研究发现，模型组大鼠肝脏TRB3蛋白及mRNA表达水平明显升高，与Du等〔16〕的研究结果一致。而对丝胶治疗组大鼠用丝胶蛋白灌胃治疗后发现大鼠血糖水平明显降低，肝脏TRB3蛋白及mRNA的表达显著下降，提示丝胶可通过下调TRB3的表达，减少对Akt磷酸化及转膜的抑制作用，使Akt活化增加，从而促进葡萄糖转运蛋白对葡萄糖的转运、加速糖原合成酶激酶-3介导糖原合成及增加过氧化物酶刺激因子受体协作子α磷酸化后对肝细胞糖异生的抑制作用，这三方面作用的最终效应将促进肝脏胰岛素PI3K/Akt信号转导通路对糖代谢的调节，从而使得丝胶治疗组大鼠血糖显著降低。

因此，本研究推测丝胶可通过TRB3影响肝脏胰岛素PI3K/Akt信号转导通路中Akt的表达而降低糖尿病大鼠的血糖，这可能是丝胶降血糖的作用机制之一。