银杏叶提取物对甲状腺癌细胞PI3K/Akt信号通路的影响及意义

刘铁钢 闻春艳 申铉三

(1内蒙古民族大学附属医院普外科，内蒙 通辽 028000；2吉林大学中日联谊医院病理科)

甲状腺癌是临床最为常见的人体内分泌器官恶性肿瘤，其发病率逐年增高，病程进展缓慢具有很强的隐匿性〔1～3〕。银杏叶能活血化瘀、清除氧自由基、保护细胞膜稳定；其提取物含银杏总黄酮、银杏内酯能抗氧化降血脂，近年来发现其在抗肿瘤方面有一定的疗效，对肝癌、胃癌、甲状腺癌及卵巢癌癌细胞具有杀伤作用，但其作用机制尚不清楚〔4～7〕。本实验探究银杏叶提取物对甲状腺癌TPC-1细胞株磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料和设备 甲状腺癌TPC-1细胞株购于中国医学科学院细胞库；银杏叶提取物购于上海研生生化试剂有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清、抗生素、胰酶、96孔培养板、6孔培养板、25 cm2培养瓶购于Hyclone公司；噻唑蓝(MTT)试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；兔抗PI3K、Akt、硫酸化(p)-Akt和鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3购于CST有限公司；Trizol购于长春鼎国生物有限公司；Taq酶、marker和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购于北京鼎国生物有限公司；引物购于上海生物工程有限公司。酶标仪、ABI7300实时荧光定量PCR仪、Biometra PCR扩增仪(Biotek公司，美国)。

1.2细胞培养和分组 将购买的冻存甲状腺癌TPC-1细胞株复苏， 置于25 cm2培养瓶中(含 10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI1640培养基)；放入37℃、5%CO2体积分数的孵箱中孵育；次日换液，待细胞铺满瓶壁80%～90%时进行传代分组。分为空白组、银杏叶低剂量组(5 μmol/L)、银杏叶中剂量组(10 μmol/L)、银杏叶高剂量组(20 μmol/L)，实验分为3个时间点：培养24 h、48 h和72 h。

1.3MTT检测细胞增殖活性 将铺满瓶壁80%～90%甲状腺癌TPC-1细胞用0.25%胰酶消化接种于96孔培养板，每孔90 μl(3 000～5 000个细胞)设置5个复孔为一组，然后空白组、银杏叶低、中、高剂量组分别加入10 μl同体积的培养液及低、中、高剂量银杏叶提取物，培养24 h、48 h和72 h；4组分别培养至相应时间点，每孔分别加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，继续培养4 h后弃上清液，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)震荡10 s，通过酶标仪在570 nm的波长处检测OD值；细胞增殖率=(细胞组OD值/参照OD值)×100%。

1.4免疫组织化学法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白和凋亡蛋白caspase-3的蛋白含量 细胞接种于6孔培养板，设置5个复孔为一组，事先在培养板中放入24 mm×24 mm的盖玻片，使得细胞爬片生长，待细胞铺满50%～70%时，4组按剂量加入试验用药培养24 h、48 h和72 h；培养至相应时间点终止培养，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗爬片5 min/3次，用冷丙酮固定15 min，晾干准备进行SP法免疫组织化学染色，染色结果细胞质阳性棕黄色，细胞核用苏木精复染为蓝色。采用Motic Images Advanced3.2图像分析软件对细胞半定量分析，结果以光密度值(OD值)表示，OD值越大阳性表达越强。

1.5实时荧光定量PCR法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白和凋亡蛋白caspase-3 mRNA水平 用Trizol提取细胞总RNA，所有样本基因扩增3次，检测PI3K、Akt、p-Akt和凋亡蛋白caspase-3 mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平。

1.6统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行F检验和t检验。

2 结 果

2.14组甲状腺癌TPC-1细胞株MTT细胞增殖率的比较 与空白组比较，银杏叶提取物低、中、高剂量组MTT细胞增殖率均明显下降，银杏叶提取物能够抑制甲状腺癌TPC-1细胞株增殖，且随时间延长和剂量增加效果更为显著，各时间点间、各剂量组间均差异显著(P<0.05)；见表1。

表1 4组培养不同时间点甲状腺癌TPC-1细胞株MTT细胞增殖率的比较

与空白组比较：1)P<0.05，与银杏叶低剂量组比较：2)P<0.05;与银杏叶中剂量组比较：3)P<0.05；表2同

2.24组甲状腺癌TPC-1细胞株PI3K、Akt、p-Akt、caspase-3的蛋白和mRNA含量比较 与空白组比较，银杏叶低、中、高剂量组PI3K和p-Akt的蛋白和mRNA含量均显著降低且随剂量增加效果更为显著(P<0.05)，银杏叶低、中、高剂量组caspase-3的蛋白和mRNA含量均显著升高且随剂量增加效果更为显著(P<0.05)，银杏叶低、中、高剂量组Akt蛋白和mRNA含量未见显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 4组甲状腺癌TPC-1细胞株PI3K、Akt、p-Akt、caspase-3的蛋白和mRNA含量比较

3 讨 论

甲状腺癌发病机制复杂，目前尚不清晰，从分子病理学角度观察，其病变发生、发展与其他恶性肿瘤有相似之处〔1,8,9〕。很多恶性肿瘤的发生与机体内复杂的信号通路密切相关，因此信号通路的相关蛋白就是作用的关键所在〔10〕。

PI3K/Akt信号通路在肿瘤中失调控，通路相关蛋白失平衡就会刺激肿瘤细胞增殖活性和加速肿瘤细胞侵袭转移，目前PI3K/Akt信号通路已被发现其在乳腺癌、结肠癌等有调控作用〔10～12〕。在肿瘤发病机制的探索阶段，细胞凋亡是常用研究手段，caspase-3是凋亡促进基因，它是细胞凋亡的核心执行者也就是凋亡的共同通路，caspase-3的活化能刺激诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖、分化〔13,14〕。

已有研究证实银杏叶提取物在肝癌、胃癌、卵巢癌中的抗癌作用，但作用机制不甚明了〔6，7，15〕。本文结果提示，银杏叶提取物抑制甲状腺癌TPC-1细胞株的增殖，可能与调控PI3K/Akt信号通路和促进细胞凋亡密切相关，并可见浓度依赖趋势。