肾素-血管紧张素系统拮抗剂对慢性脑缺血大鼠神经血管单元的影响

陈亚雪 李国春 张红 尹加珍 黄新武

(西南医科大学 1药学院，四川 泸州 646000；2附属中医院)

脑血管意外中缺血性脑损伤约占87%〔1～3〕，是致残率最高的疾病。目前，治疗脑卒中多采用溶栓和单纯神经细胞保护的方法，用药时间窗狭窄〔4〕，加上血液再灌注带来的损伤，对神经细胞功能的保护疗效有限。自2002年由美国神经疾病与脑卒中研究所提出神经血管单元(NVU)概念以来〔5〕，人们对NVU这一整体概念越来越重视。对脑的保护也从单一神经保护转变为对NVU的多种成分的研究。NVU是由神经元-胶质细胞-血管构成，是神经系统结构和功能的基本单位。因此，在脑缺血发生时，是否能较好地保护屏障系统，调节促进NVU功能结构恢复，成为脑缺血发生后保护大脑的重要机制，也成为脑缺血发生后治疗的新靶点。研究表明，脑内有独立的肾素-血管紧张素系统(RAS)，并且高血压能够促进炎性反应和炎性细胞的浸润，加重缺血再灌注后脑损害，而脑缺血再灌注损伤时炎性反应又促进了缺血性脑病的继发性脑损害，因此，抗高血压药物干预治疗及脑缺血性再灌注损伤时脑保护一直是临床关注的重点课题〔6〕。RAS拮抗剂是治疗高血压的常用药物，先前研究表明该类药物具有明显改善脑缺血所致血管性痴呆大鼠学习记忆能力的作用〔7〕。本研究通过RAS拮抗剂对脑缺血大鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、层黏连蛋白(LN)、水通道蛋白(AQP)4、神经元核抗原(NeuN)表达的影响，进一步探讨其对NVU的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD大鼠50只，体重(200±10)g，SPF级，由西南医科大学SPF动物医学实验中心提供。

1.2药物及试剂 药物：阿利吉仑(武汉三洹医药化工有限公司，批号：SH160319)、依那普利(扬子江药业集团江苏制药股份有限公司，批号：16110702)、坎地沙坦(浙江永宁药业股份有限公司，批号：160601)；试剂：SP免疫组化染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG12199372)、LN(北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG07254400)、NeuN(abcam公司，批号：GR249899-58)、AQP4(abcam公司，批号：GR84175-12)、GFAP(proteintech公司，catalog number：16825-1-AP)、二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG12073405)、免疫染色一抗稀释液(biooler公司，批号：171105)、凋亡TUNEL试剂盒(美国ROSS公司，批号：0000115114)。

1.3造模、分组与给药 SD大鼠适应性喂养1 w，随机分为正常组、模型组、阿利吉仑组、依那普利组、坎地沙坦组各10只。采用不同时点间隔3 d永久性结扎左右侧颈总动脉制备慢性脑缺血大鼠模型〔8〕，正常组不结扎血管，模型制作成功后，分别灌胃给药。用药量按照人与大鼠每kg体重占体表面积相对比值计算，阿利吉仑30 mg/(kg·d)、依那普利4 mg/(kg·d)、坎地沙坦2 mg/(kg·d)。按照1 ml/100 g灌胃量及用药量用蒸馏水配制相应浓度的药物，正常组和模型组给予等量的蒸馏水灌胃，1次/d，持续30 d。

1.4标本采集 用药结束，大鼠禁食过夜，1%戊巴比妥钠(0.3 ml/100 g)麻醉，进行心脏灌注固定，剪开大鼠心脏，插入灌注针，先用生理盐水(加肝素)冲洗至右侧心耳流出液无血色，换用4%多聚甲醛灌注固定，直至鼠尾变硬，大鼠耳唇、眼、四肢灰白后，断头取脑，放入4%多聚甲醛继续固定过夜，石蜡包埋切片。

1.5指标检测方法 按照试剂盒说明书步骤采用SP免疫组化方法分别检测GFAP、LN、AQP4、NeuN的表达情况。凋亡染色按照试剂盒说明书步骤进行染色。采用ImageJ图像分析处理软件，选取典型着色区域，测量积分光密度(IOD)，取平均值。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组GFAP及AQP4水平 光镜下观察，免疫组化染色阳性GFAP呈棕黄色，放射状；AQP4呈血管状棕黄色。与正常组相比，模型组脑组织GFAP、AQP4免疫阳性蛋白数明显减少(P<0.05)；与模型组相比，阿利吉仑、依那普利及坎地沙坦组GFAP、AQP4明显增加(P<0.05)。见表1和图1。

2.2各组LN及NeuN水平 光镜下观察，免疫组化染色阳性LN呈棕色颗粒。与正常组相比，模型组脑组织LN、NeuN免疫阳性蛋白数明显减少(P<0.05)；与模型组相比，各用药组LN、NeuN明显增加(P<0.05)。见表1和图1。

2.3各组神经元凋亡的影响 正常组脑皮质分布较均匀，核呈圆或椭圆形，棕黄色染色较少；模型组神经细胞分布密度降低，胞核变形，蓝染加深，蓝染胞核区可见部分棕黄色；各用药组神经细胞数量也有不同程度减少，胞核变形，核蓝染加深，蓝染胞核区可见少量棕黄色染色，但与模型组相比，各用药组神经细胞密度降低程度有明显减轻，凋亡染色减少。经ImageJ图像分析处理软件选取典型阳性着色区域，测定选定区域IOD；与正常组比较，模型组IOD均显著增强(P<0.05)；与模型组比较，各用药组IOD显著减弱(P<0.05)，见表1和图2。

表1 各组脑组织GFAP、AQP4、LN、NeuN、染色及脑皮质神经元凋亡的

与模型组比较：1)P<0.05

图1 各组脑组织GFAP、AQP4、脑皮质LN和NeuN表达和神经元凋亡(免疫组化，×400)

图2 各组脑皮质神经元凋亡(HE，×400)

3 讨 论

研究表明，脑缺血后能激活脑RAS，可通过复杂的内分泌机制，直接或间接诱导脑血管内皮释放内皮素〔9〕，加重中枢血流的减少。由于脑供血不足，引起交感神经兴奋，激活外周RAS，导致血管外周阻力增加，可致脑供血进一步减少〔10〕。脑缺血后炎性改变也是加重脑缺血损伤的重要机制，最终引起神经损伤导致脑功能障碍。

GFAP是星形胶质细胞的特异性蛋白，作为其特异性标志物可反映星形胶质细胞含量高低。并且起着营养、支持、保护神经元及维持神经元的细胞代谢、离子浓度、水平衡等方面的重要作用。LN是构成基底膜的重要成分，起黏附作用，调控细胞的生长、迁移和黏附能力，同时作为神经突起促进因子，营养神经、促进神经元存活、增生和神经突起的生长。AQP4主要分布于中枢神经系统，其上调易化水分子从脑实质向血管内转运，促进水肿消退〔11〕。同时，研究发现，AQP4与血脑屏障(BBB)关系密切，神经星形胶质细胞足突参与了BBB的构成，其末梢于毛细血管周围形成胶质界膜，此界膜占毛细血管表面积的85%～99%，AQP4则密集分布于胶质细胞足突上。NeuN为表达在神经系统大多数神经元胞核和胞质中的特异性蛋白质，是神经元的特异性标记物。因此，这几个物质被认为是研究NVU的重要指标，能很好地反映NVU保护改善情况。

本实验表明，脑缺血发生后阿利吉仑组、依那普利组、坦地沙坦从不同环节拮抗RAS的活性，已有研究报道，肾素抑制剂阿利吉仑能够降低还原型辅酶Ⅱ的氧化酶活性，减轻氧化应激，减轻脑组织损伤〔12〕。血管紧张素转化酶抑制剂能够升高脑海马和皮质三磷酸腺苷水平，增强线粒体的稳定性，减少活性氧簇产生，保护脑组织〔13，14〕。坎地沙坦则为选择性血管紧张素Ⅱ受体(AT1)拮抗剂，通过与血管平滑肌AT1受体结合而发挥拮抗血管紧张素Ⅱ的作用。本实验发现，RAS拮抗剂分别从不同环节拮抗RAS作用，是机体对缺血损伤自动修复的表现。