miRNA对内皮祖细胞作用的研究进展

尹航，王梦杰，刘祺，孔淑琦，刘文文，杨娜娜，赵英会

(1.山东第一医科大学a.临床医学院，b.基础医学院，山东 泰安 271000； 2.潍坊医学院生物科学与技术学院，山东 潍坊261000)

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体，它可以增殖、分化形成内皮细胞。在动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)中，EPCs能够修复损伤的血管内皮，减缓As的发生。近年来，EPCs与As的研究已成为As治疗研究中的热点。微RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子非编码RNA，具有调控生物生长发育和治疗疾病的功能。研究证实，miRNA与血管发生密切相关[1]，在As的治疗、诊断和风险预测中具有广阔的应用前景。目前，关于miRNA在冠状动脉事件发生过程中作用的研究较多，但对于miRNA在EPCs中的作用研究却较少。研究表明，有些miRNA具有调控EPCs的功能[2]。现就miRNA在EPCs中作用的研究进展予以综述，以探讨如何利用miRNA增强EPCs修复血管内皮、改善As的作用。

1 miRNA相关介绍

1.1miRNA的作用及作用机制 1993年，人类首次在秀丽隐杆线虫中发现能够控制细胞表达的miRNA，命名为lin-4[3]。目前，在超过200种物种中鉴定出超过25 000种miRNA (http：//www.mirbase.org)，miRNA是最近研究较多的内源性非编码小RNA，多存在于真核生物中。miRNA的生物学作用及作用方式较复杂，编码miRNA的基因存在于细胞核中，被RNA聚合酶Ⅱ转录生成长度数千个碱基的初级转录物。在细胞核内，初级转录物在蛋白质复合体(400 000～500 000)的作用下经过了第一次加工，该蛋白质复合体由Drosha(RNase Ⅲ蛋白)和Pasha(双链RNA结合蛋白)两个蛋白质组成，初级转录物在Drosha的作用下被加工成具有发夹结构的miRNA前体；miRNA前体在RanGTP/Exportin-5转运蛋白的协助下从核内转运到细胞质中；在细胞质中，RNase Ⅲ酶家族的Dicer酶识别miRNA前体并通过对茎环结构的剪切和修饰，使miRNA前体形成约20个碱基对长的miRNA产物，这种miRNA与Argonaute家族蛋白形成RNA诱导的沉默复合体，最终miRNA被降解，miRNA在转录后通过下调靶基因来调控基因的表达，该机制则取决于miRNA与靶基因信使RNA的互补程度，若两者能形成完全互补的RNA双链，则miRNA将双链中的信使RNA降解，沉默基因转录后表达；若两者形成非完全互补的杂交双链，则会特异性地抑制基因表达。

miRNA在结构和功能上具有一些鲜明的特点：①长度一般在20～25个碱基；②普遍存在于不同生物个体中，包括线虫、果蝇、植物和人类等；③在不同的生物中，miRNA的序列具有一定的保守性，但尚未发现动物与植物之间有完全相同的miRNA序列；④有明显的表达阶段特异性和组织特异性；⑤基因组中的miRNA基因以多种形式存在，包括单拷贝、多拷贝或基因簇等；⑥一种miRNA可以靶向多种信使RNA(可超过200种)，且一种信使RNA也可由多种miRNA靶向。有研究显示，miRNA可以调节30%以上的蛋白质的编码基因，表明其参与了细胞的生长、分化、衰老、凋亡、自噬、迁移、侵袭等多种过程，证实了其对基因表达的调节[4]。

1.2miRNA与As 正常内皮细胞具有调节血管紧张度、抗凝、抗血小板等作用，还具有分泌纤溶蛋白、防止细胞向血管壁黏附聚集和抗炎症反应的作用，故内皮细胞损伤会引起并加剧As。在As发生过程中，首先表现出慢性炎症对血管内皮细胞的损伤，在趋化因子和黏附分子的共同作用下，单核细胞及T细胞等炎症细胞迁移至动脉内膜下分化为巨噬细胞，促进循环中单核细胞与内皮细胞黏附，在血管壁中迁移、吞噬脂质，进而衍化为巨噬泡沫细胞甚至粥样病变。

多个miRNA参与调控动脉血管内皮细胞慢性炎症反应，影响As斑块的发生发展。Wu等[5]研究显示，miR-155通过对内皮细胞的负反馈调节发挥抗As作用，其机制主要是通过抑制肿瘤坏死因子-α诱导单核细胞向内皮细胞黏附。miR-125a-5p通过下调氧化固醇结合蛋白相关蛋白-9的表达，减少巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白的摄取；并且抑制白细胞介素-2、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等相关炎症因子的基因表达[6-8]。研究发现，miRNA具有抑制血管内皮细胞增殖和迁移、促进内皮细胞凋亡、诱导内皮细胞衰老并阻滞细胞周期、参与血管内皮细胞炎症调节的作用[9-12]。由此可见，miRNA与As的紧密联系，利用miRNA治疗As具有广阔的应用前景。

2 EPCs的相关介绍

2.1EPCs的特征 EPCs是血管内皮细胞的前体，是一种多能干细胞，由Asahara等[13]于1997年利用免疫分选的方法从人外周血中分离出来。目前，人类已可以从脐血、骨髓、外周血和胚胎肝脏中分离培养出EPCs，其中骨髓中分离出的最多。未分化的EPCs呈圆形，形态上很难与其他细胞区分，现主要依靠细胞表面标志来区别。大多数学者认为，同时具有CD34+、CD133+和血管内皮生长因子受体-2等表面抗原标志物的细胞称为EPCs[14-16]。

2.2EPCS与As的研究进展 血管成形术或转流手术后的内皮损伤和脱失是形成As的重要病理基础。加快损伤内皮的修复，及时恢复稳定的内皮功能，能够有效预防血栓形成。由于内皮细胞是成熟的终末细胞，分化程度高且增殖能力低，当血管内皮损伤时，内皮细胞的修复能力有限，且一些较重的血管内皮损伤不可逆转；而EPCs可以通过分泌血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子促进内皮细胞的血管新生[17]。Griese等[18]对球囊诱导兔颈动脉内皮损伤剥脱实验的研究发现，移植4 d时，自体移植EPCs组颈动脉内皮损伤处基本已完全复内皮化，而无EPCs移植对照组几乎无复内皮发生；4周后，自体移植EPCs组新生内膜的形成较无EPCs移植对照组显著增多。因此，EPCs可用于As的预防和治疗。

3 miRNA调控EPCs功能的机制

3.1miRNA调控EPCs增殖 研究发现，在缺氧状态和发生As时，EPCs中miR-21的表达均增加，EPCs的增殖能力均下降[19]。EPCs中miR-21的敲低改善了缺氧诱导的细胞生长停滞。荧光素酶报告基因测定法显示，miR-21通过直接靶向WWP1的3′非翻译区下调含WW结构域蛋白1(TGF-β信号传导的负调节因子)的表达，而EPCs中miR-21过表达或WW结构域蛋白1敲低显著激活了TGF-β信号传导途径并抑制细胞增殖，表明miR-21可通过下调WW结构域蛋白1激活TGF-β信号传导来抑制EPCs增殖。

miR-221/222的生理作用与内皮细胞的增殖也密切相关。采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)测量稳定冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)患者和非CAD患者。将CAD患者随机分为阿托伐他汀组(口服阿托伐他汀10 mg/d)和普伐他汀组(口服普伐他汀10 mg/d)，治疗12个月后，检测两组外周血EPCs中miR-221/222的水平显示，CAD组miR-221/222水平显著高于非CAD组(P<0.01)[20]。miR-221/222水平与CAD组EPCs数量呈弱负相关，推测miR-221/222可能抑制EPCs的增殖。

miR-10b和miR-196b能够促进肿瘤EPCs的增殖[21-23]。研究发现，骨髓内的EPCs可以参与小鼠和人肿瘤血管生成依赖性生长的过程[24]。EPCs通过促血管生成生长因子的旁分泌以及直接参与新生血管调节血管内皮的生成。miRNA是细胞过程的关键调控因子，包括血管生成过程。研究发现，miRNA处理酶Dicer的基因消融，特别是减少了骨髓中循环EPCs的数量，导致血管生成抑制和肿瘤生长受损[24]。此外，miRNA的全基因组深度测序揭示了肿瘤EPCs的固有miRNA，包括miR-10b和miR-196b，被认为是HOX信号和成体干细胞分化的关键调控因子。值得注意的是，miR-10b和miR-196b对血管内皮生长因子的刺激均有反应，并在人类高级别乳腺肿瘤血管系统中表达增高。靶向miR-10b和miR-196b导致小鼠血管生成介导的肿瘤生长出现明显缺陷[24]。因此，靶向上述miRNA可能是抑制肿瘤血管生成的新策略。

在糖尿病患者中，抑制miR-126基因表达会抑制EPCs增殖；而miRNA表达恢复后，EPCs的增殖也得到促进[25]。研究表明，miR-31a-5p是EPCs动员和内皮化的重要调节因子，可能对动脉瘤修复有积极作用[26]。利用成年雄性Sprague-Dawley大鼠经显微外科制作螺旋栓塞动脉瘤模型，经尾静脉注射miR-31a-5p agomir或阴性对照agomir，剂量为10 mg/(kg·周)，持续4周，采用苏木精-伊红染色、电镜扫描和流式细胞术观察miR-31a-5p agomir对内皮化和EPCs数量的影响发现，miR-31a-5p对EPCs活性和功能的影响则通过细胞计数试剂盒Kit-8、伤口愈合实验和试管形成实验来测定；检测miR-31a-5p促进EPCs诱导的动脉瘤血管内皮化的能力，与阴性对照组相比，miR-31a-5p agomir能改善内皮化，增加外周血循环EPCs的数量。

3.2miRNA调控EPCs分化 miR-107可以调控EPCs的分化。从大鼠骨髓中分离EPCs，并通过实时荧光定量PCR测量缺氧和常氧时EPCs中miR-107的表达，使用慢病毒载体表达短发夹RNA和miR-107抑制剂靶向缺氧诱导因子-1β(hypoxia-inducible factor-1β，HIF-1β)和miR-107以改变HIF-1β和miR-107表达；在低氧条件下，EPCs中miR-107的表达增加，miR-107的上调部分抑制了缺氧诱导的EPCs分化，而miR-107的下调促进了EPCs分化，HIF-1β是相应靶基因，表明缺氧时miR-107上调并通过靶向HIF-1β阻止EPCs分化[27]。

流动剪切应力在EPCs分化调节中起重要作用，确定新型靶Forkhead盒j2(Foxj2)和miR-34a对剪切应力诱导的EPCs分化的影响。使用平行板流动室系统将人脐带血衍生的EPCs暴露于15 dyn/cm2的层流剪切应力中，实时荧光定量PCR显示，伴随EPCs的内皮分化，剪切应力显著增加了miR-34a的表达；而Foxj2是由多种算法预测的miR-34a的推定靶标，在此过程中受到抑制[28]。采用双荧光素酶报告基因测定以及miR-34a模拟物和抑制剂治疗证实 miR-34a和Foxj2之间相互作用的研究揭示了miR-34a和Foxj2表达的逆相关性，同时涉及EPCs的内皮分化[28]。miR-34a通过上调内皮细胞标志物和下调平滑肌细胞标志物促进EPCs分化。此外，Foxj2过表达减弱了EPCs的内皮分化，而Foxj2小干扰RNA具有相反的作用，这些数据表明了剪切应力诱导miR-34a表达的独特机制，miR-34a靶向Foxj2并促进EPCs的内皮分化[27]。既往研究显示，糖尿病患者的内皮功能障碍导致血管疾病，且EPCs对血管内皮的功能性保存是必不可少的[29]。

以往Satb2被认为是EPCs中miR-31的功能相关靶标。有研究显示，糖尿病患者EPCs中miR-31的表达显著升高，且这种升高可在高葡萄糖条件下抑制细胞的增殖，此外，miR-31靶向Satb2还具有抗细胞凋亡和维持EPCs功能的作用[30]。敲低Satb2对健康和糖尿病患者EPCs的增殖和迁移均有抑制作用，呈现与miR-31过表达相同的趋势，而Satb2过表达则显示出相反的效果。在糖尿病受试者EPCs中发现，葡萄糖水平升高上调miR-31表达，导致了EPCs的功能障碍和死亡。总之，miR-31可能是糖尿病内皮功能障碍的基础，miR-31上调可能靶向Satb2，从而调节EPCs的分化[30-31]。

3.3miRNA调控EPCs迁移 在早期EPCs中，观察到miR-150高表达与CXC趋化因子受体4低表达相关[28]。腺苷是一种具有心脏保护作用的核苷，可降低miR-150的表达、增加CXC趋化因子受体4的表达，增强EPCs的迁移[32]。这说明在缺血期间，miR-150下调骨髓来源的单核细胞中的CXC趋化因子受体4，EPCs的迁移能力减弱；当miR-150被抑制时，EPCs的迁移能力增强[33]。Sun等[34]研究发现，通过transwell实验和管形成实验研究miR-126的EPCs衍生外泌体(miR-126-Exo)对EPCs迁移和管内结合能力的作用发现，miR-126-Exo可以增强EPCs的迁移和管内结合能力。此外，EPCs还可高表达促血管生成的miRNA，如miR-31[35]，为miRNA调控EPCs的迁移奠定基础。

3.4miRNA调控EPCs凋亡和衰老 EPCs衰老的潜在机制尚不清楚，但越来越多的证据支持miRNA在调节细胞衰老中的作用。Kato等[36]的研究发现，miR-34a可能参与了吸烟者EPCs的凋亡和衰老。Zhu等[37]研究亦证实，miR-10A*和miR-21通过抑制Hmga2表达调节EPCs的衰老。对糖尿病患者的研究发现，miR-126可以抑制EPCs的凋亡[25]。糖尿病会严重影响循环EPCs的数量和功能，并可降低EPCs的修复能力，这是糖尿病血管病变发展的关键和始动因素。在此研究中，EPCs来自2型糖尿病患者和非糖尿病对照组，从EPCs中提取总RNA，经基因芯片筛选和TaqMan实时荧光定量PCR筛选出miR-126，将表达miR-126和miR-126抑制剂的慢病毒载体转染至EPCs，检测EPCs的凋亡敏感性，并进行Western Blotting和miRNA实时荧光定量PCR分析；同时为了研究其作用机制，制备了表达Spred-1的慢病毒载体和靶向Spred-1的小干扰RNA。结果发现，糖尿病患者EPCs中miR-126异常下调，而抗miR-126会增强EPCs的凋亡[25]。糖尿病EPCs中miR-126表达的恢复抑制了EPCs的凋亡能力，EPCs中miR-126过表达显著下调Spred-1，而糖尿病EPCs中Spred-1表达下调抑制了EPCs的凋亡[25]，证明糖尿病患者EPCs中miR-126下调，且具有抑制EPCs凋亡的作用。可见，应用miRNA调控EPCs的凋亡和衰老具有很高的研究价值。

4 小 结

As是老年性常见疾病，严重影响人类健康。调控EPCs延缓或修复As血管内皮是目前研究的热点。miRNA作为新发现的生物小分子，参与了多阶段的生命过程，具有调控EPCs增殖、分化、迁移、凋亡和衰老的能力，体现了应用miRNA促进EPCs内皮化以治疗As的可行性。miRNA具有靶向多种蛋白质编码基因的能力，具有调节复杂生物过程(如血管生成)的潜力，但其多效性可能导致不良事件的发生，如何避免不良事件发生也是下一步研究的关键问题。目前，许多研究者聚焦miRNA调节EPCs的研究，未来应用miRNA调节EPCs治疗As可能成为一种重要的方式。