菝葜根茎色素的提取及稳定性研究

乔高翔，杨丽聪，郑国栋

（江西农业大学江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌330045）

菝葜（Smilax china L.）又名金刚刺，属于多年生藤本落叶攀附植物[1]，一般生于海拔2000 米以下，常长在丛林、山谷、道路旁，由于生长环境不为严苛，在诸多地区极为多见。菝葜属植物在全世界达300 多种[2]，在我国也有不少种属和一些变种植物，分布于中国长江以南各地[3]。菝葜药性平和，多作用于肝肾，有治疗疲血、风湿、痢疾等功效[4]，是中药中使用的常见药材，菝葜还有活血化瘀、治疗跌打损伤，强壮筋骨的作用[5]，故民间常以菝葜作引用来酿酒。菝葜全身是宝，其根、茎、叶均有不同的药理效用，新鲜菝葜叶还可用于治疗烫伤、烧伤。现代药理学研究还发现了菝葜的抗肿瘤、预防风湿的功能、对高血糖和炎症也有缓解的功效[6]。

菝葜根茎含有多种对人体有益的化合物，它的成分包含甾体皂苷、酚类化合物、芪类等类型的化合物[7]。这些化合物都有很强的药理性，被广泛学者研究。其中甾体皂苷有很强的生理活性，皂甙是一类极性较强的大分子化合物，具有止血、抗肿瘤和调节心血管的作用[8]；酚类化合物具有很强的抗氧化性，例如菝葜根茎里面所含的类黄酮色素，其内所含有的黄酮醇有着较强的抗氧化性和抗还原性，在药理学上对溃疡、病毒、炎症都有很强的抗性，也有解痉、降血脂和镇痛的能力[9]；芪类化合物是指具有均二苯乙烯母核或其聚合物的一类物质的总称，当受到病菌感染或其他外界刺激的时候，芪类化合物就会增多，它是植物的天然应激产物，在药理学上具有抗菌，治疗高血脂症的功效，还有保护肝脏，扩张毛细血管和冠状血管的作用[10]。

近年来，随着人们生活条件的提高，对食品安全问题高度重视，天然色素走入大众视野，随之天然色素的染色着色，生理活性的开发与利用己成为各行业科技工作者普遍关注的课题[11]。因此，菝葜根茎提取出的天然色素具有广阔的发展前景，对菝葜色素的研究目前集中在对菝葜组成成分的报道，而对其丰富的根茎色素资源却极少见研究报道。本研究从菝葜根茎的色素入手，为开发利用菝葜属种类这一丰富资源，增加其经济附加值、美化环境及寻找天然食品着色剂提供依据。

本试验采用L9（33）正交表排列优化进行重复性验证试验，采用乙醇提取法对菝葜根茎色素进行提取，把乙醇的体积分数、料液比及提取时间等作为测定因素，控制单一变量，探究其对菝葜根茎色素提取效果的影响，同时探究了氧化还原剂及金属离子对菝葜根茎色素稳定性的影响[12]。为菝葜根茎色素稳定性研究与开发利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菝葜根茎：南昌荣佳药业。

95%乙醇、石油醚、H2O2和 Na2SO3、氯化钠、氯化钾、六水合氯化铝、无水氯化钙、三氯化铁等金属盐（分析纯）：南昌宝灵试剂公司。

1.2 仪器

SHMADZU-AUY120 电子分析天平：上海卓精电子科技有限公司；HH60 数显恒温搅拌循环水箱：常州国华电器有限公司；V-5600 Spectrophotometer 紫外可见光谱仪：上海元析仪器有限公司。

1.2 菝葜色素提取工艺

1.2.1 提取试剂的选择和确定

称取3 份备用的菝葜根茎样品，每份1 g，加入10 mL 的水、95%乙醇和石油醚，将管口封住，放在40 ℃下避光处水浴浸提0.5 h，冷却到25 ℃后，对色素提取液进行过滤操作处理，得到菝葜根茎色素的提取液，观察色素液颜色并测定其在340 nm 处的吸光度值，以确定最合适的提取溶剂，每个试验3 次重复。

1.2.2 确定最大吸收波长

称取备用的菝葜根茎样品1 g，与10 mL 95%乙醇溶液配制成料液比 1 ∶10（g/mL）的溶液，在 40 ℃下水浴浸提0.5 h，冷却到25 ℃后对色素提取液进行过滤操作处理，得到菝葜根茎色素的提取液，并用紫外可见光谱仪比较在320 nm～600 nm 波长范围内最大吸收波长处的吸光度值，每个试验重复3 次。

1.2.3 菝葜色素提取条件单因素试验

1.2.3.1 提取剂浓度对菝葜色素量的影响

称取6 份菝葜根茎粉末，每份1 g，分别置于干净的离心管中，分别加入40%、50%、60%、70%、80%、95%的不同体积分数的乙醇溶液10 mL，将管口封住，放在20 ℃下避光处水浴浸提0.5 h，冷却到25 ℃后，对色素提取液进行过滤操作处理，得到菝葜根茎色素的提取液，测定其在340 nm 处的吸光度值，以确定最合适的提取溶剂的浓度，每个试验重复3 次。

1.2.3.2 提取温度对菝葜色素量的影响

称取6 份菝葜根茎粉末，每份1 g，分别置于干净的离心管中，加入95%乙醇10 mL，将管口封住，分别放在不同温度（20、30、40、50、60、70 ℃）下避光处水浴浸提0.5 h，冷却到25 ℃后，对色素提取液进行过滤操作处理，得到菝葜根茎色素的提取液，测定其在340 nm处的吸光度值，确定最为合适的提取温度，每个试验重复3 次。

1.2.3.3 提取料液比对菝葜色素量的影响

称取5 份菝葜根茎粉末，每份1 g，分别置于干净的离心管中，分别加入 95%乙醇 10、15、20、25、30 mL，将管口封住，放在20 ℃下避光处水浴浸提0.5 h，冷却到25 ℃后，对色素提取液进行过滤操作处理，得到菝葜根茎色素的提取液，测定其在340 nm 处的吸光度值，确定最合适的提取料液比，每个试验3 次重复。

1.2.3.4 提取时间对菝葜色素量的影响

称取5 份菝葜根茎粉末，每份1 g，分别置于干净的离心管中，分别加入95%乙醇10 mL，将管口封住，分别放在 20 ℃下避光处水浴浸提 0.5、1、1.5、2、2.5 h，冷却到25 ℃后，对色素提取液进行过滤操作处理，得到菝葜根茎色素的提取液，测定其在340 nm 处的吸光度值，确定最合适的提取时间，每个试验3 次重复。

1.2.4 菝葜色素提取正交试验

根据上述单因素试验的结果进行极差分析，选用提取温度、提取时间、提取剂浓度作为正交试验因素，通过比较吸光度值这个指标来进行评价，设计L9（33）正交试验表，优化改进对菝葜根茎色素的提取工艺条件，其正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素和水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

1.3 菝葜根茎色素稳定性测定试验

选取正交试验中温度、时间、提取剂浓度的最优结果，进行提取一定量的菝葜根茎色素溶液，稀释至所需浓度备用。

1.3.1 氧化剂和还原剂对菝葜根茎色素稳定性的影响

取8 份6 mL 的色素溶液于25 mL 离心管中，分别加入 0、1、2、3 mL 体积分数为 30%的 H2O2溶液和 0、1、2、3 mL 浓度为 0.1 mol/L 的 Na2SO3溶液，用蒸馏水定容至10 mL，室温25 ℃下放置24 h 后，测定其在340 nm 处的吸光度。

1.3.2 常见金属离子对菝葜根茎色素稳定性的影响

取6 份5 mL 的色素溶液于10 mL 离心管中，分别加入 1 mL 的含有 Na+、K+、Al3+、Ca2+、Fe3+的溶液，另取一支加1 mL 蒸馏水，每支离心管均定容至10 mL，室温25 ℃下放置24 h 后，分别观察比较各试管现象并测定其在340 nm 处的吸光度。

1.4 数据分析

所有的试验数据平行3 次，结果表示为平均值±SD。数据用单因素方差分析进行分析，然后用SPSS软件版本21 进行Duncan's 检验。显着水平设置为p ＜0.05。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的选择和确定

菝葜根茎色素在不同溶剂下提取效果的影响见表2。

表2 菝葜根茎色素提取试剂的选择和确定Table 2 Selection and determination of rhizome pigment extraction reagent from Smilax china L.

由表2 可知，在其他条件相同的情况下，菝葜根茎色素在不同溶剂下提取效果的影响不同[13]，95%乙醇对菝葜根茎色素的提取效果最佳，因此本试验选用95%乙醇作为菝葜根茎色素的提取剂。

2.2 最大吸收波长的确定

菝葜根茎色素提取物全波长扫描的吸光值如图1所示。

图1 菝葜根茎色素提取最大吸收波长λ 的确定Fig.1 Determination of maximum absorption wavelength of pigment extraction from Smilax china L.

由图1 可知，在320 nm～340 nm 的波长范围内，菝葜根茎色素的吸光值随着波长的增加而不断增大，当波长超过340 nm 的时候，吸光值随着波长的增加而呈下降趋势。图形中可看出在340 nm 处形成吸收峰（类黄酮类色素在250 nm～350 nm 之间有明显的吸收峰[14]）因此确定菝葜根茎色素的最大吸收波长为340 nm，并以此为标准测定各条件下的吸光度。

2.3 单因素试验对菝葜根茎色素含量影响

2.3.1 提取剂浓度对菝葜根茎色素含量的影响

提取剂浓度对菝葜根茎色素含量的关系如图2所示。

图2 提取剂浓度对菝葜根茎色素含量的影响Fig.2 The effect of extracting concentration on the content of pigment in rhizome from Smilax china L.

由图2 可知，随着提取剂乙醇体积分数的升高，菝葜根茎色素的吸光值随之升高，在乙醇浓度为50%的时候达到最大值，之后随着提取液浓度的升高而降低。原因可能是随着提取剂浓度的增大，一些杂质也随之溶出，对提取过程中提取液颜色产生了干扰。因此采用50 %的乙醇对菝葜根茎色素进行提取最为适合。

2.3.2 提取温度对菝葜根茎色素含量的影响

提取温度对菝葜根茎色素含量的关系如图3所示。

图3 提取温度对菝葜根茎色素含量的影响Fig.3 The effect of extracting temperature on the content of pigment in rhizome from Smilax china L.

由图3 可知，吸光值随着温度的升高而呈现逐渐增大趋势，在60 ℃后吸光值开始减小，因为随着温度升高，菝葜根茎色素在溶液中的溶解度逐渐增大，吸光值则逐渐增大，但当温度较高时，菝葜根茎色素可能发生了变性或者乙醇溶液挥发性影响了吸光值，故温度应选择60 ℃为宜。

2.3.3 提取时间对菝葜根茎色素含量的影响

提取时间对菝葜根茎色素含量的影响如图4所示。

图4 提取时间对菝葜根茎色素含量的影响Fig.4 The effect of extracting time on the content of pigment in rhizome from Smilax china L.

由图4 可知，随着提取时间的延长，色素的提取在不断地进行，溶出物增多，吸光值就明显增大；但在1.5 h 后吸光值开始减小，这可能是由于溶剂的溶解能力达到饱和，同时提取出的色素小部分遭到破坏，因此吸光度有所减小，故提取时间定1.5 h 为宜。

2.3.4 料液比对菝葜根茎色素含量的影响

提取时间对菝葜根茎色素含量的影响如图5。

图5 提取时间对菝葜根茎色素含量的影响Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the content of pigment in rhizome from Smilax china L.

由图5 可知，以 1 ∶10（g/mL）作为料液比对根茎菝葜色素进行提取效果最好，料液比和色素提取液的吸光值成反比，因此选用料液比1 ∶10（g/mL）来提取菝葜根茎色素效果最佳。

2.4 正交试验结果及数据分析

根据单因素试验结果，采用Design-Expert.V8.0.6.1对菝葜根茎色素含量进行分析[15]，结果见表3。

从表3 的极差分析可知，各因素对于菝葜根茎色素吸光值的影响顺序为：提取温度＞提取液浓度＞提取时间，故温度对菝葜根茎色素液的影响最为显著。通过上述正交试验的数据处理结果可知菝葜根茎色素的最佳提取工艺为：A3B2C2，即菝葜根茎色素的最佳提取条件为提取温度70 ℃，提取时间1.5 h，提取液浓度为50%乙醇溶液。然而最佳组合未在上述9 组正交试验中，因此，需对上述结果进行验证性试验。由验证试验得：采用最佳提取条件（A3B2C2）提取的菝葜根茎色素溶液吸光度值达到1.005，高于9 组正交试验中最高的色素提取液的吸光度值0.895，这说明此次正交试验优化得到的最佳组合的结果是有效的，可以使菝葜根茎色素提取液的吸光度值达到最大值。

表3 L（93）3正交试验设计及极差分析Table 3 L（93）3orthogonal test design and range analysis

2.5 菝葜根茎色素稳定性试验

2.5.1 氧化剂和还原剂对菝葜根茎色素稳定性的影响结果

氧化剂和还原剂对菝葜根茎色素稳定性的影响如图6。

图6 氧化剂和还原剂对菝葜根茎色素稳定性的影响Fig.6 The effect of oxidants and reducing agents on the stability of pigment in rhizome from Smilax china L.

由图6 所示，加入不同体积分数的氧化剂和不同浓度的还原剂，都使得菝葜根茎色素溶液吸光度变大。由文献[16]可知根茎色素中含有类黄酮色素，而这种色素里面含有黄酮醇这种物质，它具有很强的抗氧化性和抗还原性，在黄酮醇溶液中加入氧化剂和还原剂时，会使得溶液的吸光度变大。所以有可能是黄酮醇的存在导致了溶液最终的吸光值变大。故氧化剂和还原剂会使菝葜根茎色素颜色加深的作用。

2.5.2 常见金属离子对菝葜根茎色素的稳定性的影响结果

金属离子对菝葜根茎色素稳定性的影响如表4。

表4 金属离子对菝葜根茎色素稳定性的影响Table 4 Effect of metal ions on pigment Stability from Smilax china L.

由表4 可知，Na+、K+、Al3+、Ca2+、Fe3+等离子对菝葜根茎色素有着不同程度的影响作用，Fe3+离子对溶液吸光度影响较大，这可能与其离子本身颜色有关，也可能是色素液中的黄铜化合物和Fe3+发生了络合反应使吸光度增大，具体原因有待进一步的考察。其余金属离子对吸光度影响较小，其颜色也基本没有变化[17]。且24 h 后比色管的底部出现少许红白色沉淀，原因可能是盐类物质在有机溶剂中使某些成分的分配发生了变化。故实际操作中应该尽可能的避免菝葜根茎色素液与铁质容器的接触。

3 结论

菝葜根茎色素易溶于水，可溶于乙醇等极性溶剂，不溶于石油醚等非极性溶剂。菝葜根茎色素的最佳提取条件为提取温度70 ℃，提取时间1.5 h，提取液浓度为50%乙醇溶液，各因素对于菝葜根茎色素吸光度值的影响顺序依次是提取温度、提取液浓度、提取时间。由于时间和条件等一些特殊因素的限制，提取条件的优化试验研究结论还有待进一步的完善。另外在探究菝葜根茎色素稳定性的试验结果中，不同体积分数的氧化剂H2O2和不同浓度的还原剂Na2SO3对菝葜根茎色素有一定的影响；菝葜色素对大数多金属离子呈现较好的稳定性，但Fe3+使色素变色，故在生产实践中应该避免该色素与铁制品的接触。研究结果为菝葜根茎色素的开发应用奠定了基础。