ORFV感染羔羊后的组织定位及其病毒载量分析

许国洋，高广亮，余远迪，牟 豪，付利芝，沈克飞，白运川，杨 柳*

(1. 重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2. 重庆市兽用生物制品工程技术研究中心，重庆 402460；3. 酉阳县动物疫病预防控制中心，重庆 酉阳 409800)

【研究意义】羊口疮又称羊传染性脓疱(Orf)，是由羊传染性脓疱病毒引起的一种接触性人兽共患病，主要感染山羊和绵羊，也可感染驯鹿和骆驼等野生动物，偶尔感染人类[1-2]。羊传染性脓疱病毒属于痘病毒科副痘病毒属，对紫外线、乙醚和氯仿较为敏感，潮湿和高温环境可导致其活性降低[3-4]。羊传染性脓疱在山羊和绵羊中的发病率较高，各个阶段的羊均可感染，春秋季节多发[5]。该病主要侵染羊的口唇部、尾根部、乳房等，受感染部位常出现丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂，破损后常继发感染多种病原菌，加速病情恶化，造成动物机体抵抗力下降、进食困难、食欲废绝等，严重者出现死亡，是引起羔羊死亡的主要病原之一[6-7]。目前，开展的羊传染性脓疱病原学研究较多，但国内尚无可有效防治该病的商品化疫苗产品[8]，因此，开展羊传染性脓疱的病原学研究依然十分必要。【前人研究进展】McKeever D J等研究绵羊的口疮病毒，主要阐述了口疮病毒感染绵羊后对其皮肤组织的损伤机制[9]。周铭等将痂皮中的病毒在犊牛睾丸细胞中进行盲传，发现盲传至第4代开始出现细胞病变[10]。 高晶晖等利用犊牛睾丸细胞对痂皮中的羊传染性脓疱病毒进行分离，发现盲传至第5代出现细胞病变[11]。于永忠等利用MDBK细胞从患病山羊口唇部痂皮中分离到一株羊传染性脓疱病毒，同时，开展了动物回归试验，但仅对攻毒后羔羊的临床症状和血常规进行了检测[12]。目前，关于羊传染性脓疱病毒的组织分布及病毒载量未见报道。此外，笔者通过长期对重庆地区羊传染性脓疱的研究发现从痂皮样品分离纯化疫苗候选毒株概率较低，这可能与痂皮中病毒的含量、死活及其细胞适应性有关。此外，口唇部创口暴露于外界环境，常导致病原菌的混合感染，产生的内毒素和外毒素给病毒在细胞上的纯化培养造成潜在威胁。【本研究切入点】为了解决以上难题，笔者尝试对病死羔羊的多个组织进行羊传染性脓疱病毒的常规PCR检测，发现其舌、上颚、尾根部、淋巴结、鼻甲骨等组织均出现阳性样本，检出率有一定差异，但表明这些组织中可能有病毒的存在，这可能与个体差异、发病程度和检测方法有关，而关于羊传染性脓疱病毒在羔羊体内的分布情况未见报道。【拟解决的关键问题】本研究拟利用免疫组化方法和相对荧光定量PCR技术对病毒在羔羊体内分布情况进行分析，以期为羊传染性脓疱疫苗候选毒株的分离纯化及其致病机制的深入研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

组织病毒基因组提取试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker购自宝生物工程(大连)有限公司，TransStrat®Top Green qPCR SuperMix 荧光定量试剂盒购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司，设计引物F1L-F/F1L-R进行羊传染性脓疱F1L基因的常规PCR扩增，引物F1L-f/F1L-r进行相对荧光定量PCR时F1L基因的扩增，引物GAPDH-f/GAPDH-r进行相对荧光定量PCR时内参基因GAPDH的扩增，序列均由生工生物工程有限公司合成。

1.2 动物攻毒

选取4只未接种羊痘疫苗的健康断奶羔羊，避免羊痘疫苗产生交叉免疫保护，羔羊由重庆某羊场提供。随机选取3只羔羊，在其口腔下唇粘膜和尾根部皮肤进行羊传染性脓疱病毒的划痕接种，接种量为0.2 mL/只(TCID50=10-4.5/0.1 mL)，接种后，轻轻搓揉，使病毒液充分吸附，1只羔羊接种PBS 0.2 mL，设为对照组。正常饲喂，观察记录羔羊发病情况。

1.3 样品处理

待山羊出现明显的羊传染性脓疱病毒感染症状时，放血处死，采集唇部、上颚、鼻甲骨、颈前淋巴结、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠系膜淋巴结和尾根部组织样品，各取5 g，利用组织匀浆机研磨处理，3000 r/min离心10 min，取上清提取基因组，利用F1/R1引物，扩增山羊传染性脓疱病毒F1L全长基因序列，进行PCR鉴定；对PCR鉴定为阳性的组织样品，另取5 g固定，参照褚秀玲等[13]的方法处理样品，并送往重庆医科大学进行免疫组织化学染色分析。

1.4 组织病毒载量测定与分析

1.4.1 组织病毒载量测定 利用组织病毒基因组提取试剂盒提取各组织样品基因组，进行荧光定量PCR检测，每个组织样品基因做3个重复孔，荧光定量PCR反应体系为：2×qPCR SuperMix 10 μl，F1L-F/GAPDH-f(10 μmol/L) 0.5 μl，F1L-R/GAPDH-r (10 μmol/L) 0.5 μl，Template DNA 2 μl，RNase Free dH2O 7 μl；反应条件为：94 ℃ 预变性30 s，94 ℃变性5 s，61 ℃延伸35 s，40个循环；相对荧光定量PCR数据采用2-△△Ct法处理。

表1 引物序列信息

1.4.2 病毒增殖情况分析 依据不同组织中病毒载量情况，对病毒载量最高的组织样品和痂皮样品进行研磨处理，制备病毒悬液，按10 %接种量，感染OFTu细胞，观察细胞病变情况，对比分析高病毒载量的组织样品和痂皮中病毒的增殖情况。

2 结果与分析

2.1 临床症状

试验组羔羊在攻毒后10 d均出现典型的临床症状，唇部内侧和尾根部出现疱疹，14 d唇部均开始出现疣状结痂(图1)，对照组正常。

A.唇部病变(10 d)；B.尾根部病变(10 d)；C.唇部病变(14 d)A.Lip lesions(10 days)；B.Tail root lesion(10 days)；C.Lip lesions(14 days)

2.2 羊传染性脓疱病毒的组织分布

利用引物F1L-F/F1L-R对采集的样品组织进行羊传染性脓疱病毒的PCR鉴定，发现试验组羔羊的唇部、上颚、鼻甲骨、肠系膜淋巴结、颈前淋巴结和尾根部均检出羊传染性脓疱病毒，而心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏均为阴性(图2)。

M：DL2000 DNA marker；1.唇部；2.上颚；3.鼻甲骨；4.颈前淋巴结；5.心脏；6.肝脏；7.脾脏；8.肺脏；9.肾脏；10.肠系膜淋巴结；11.尾根部M：DL2000 DNA marker；1.Lip; 2.Palate; 3.Turbinate bone; 4.Anterior cervical lymph nodes; 5.Heart; 6.Liver; 7.Spleen; 8.Lung; 9.Kidney; 10.Mesenteric lymph node; 11.Tail root

2.3 免疫组化

通过对不同组织的免疫化学分析，发现试验组羔羊唇部、上颚鼻甲骨、颈前淋巴结、肠系膜淋巴结和尾根部组织细胞中均出现阳性印迹(图3)，可见棕黄色颗粒弥散性分布，其中，唇部、尾根部、鼻甲骨、上颚反应强烈，为强阳性，颈前淋巴结表达量适中，肠系膜淋巴结表达量较低。

A：唇部；B：上颚；C：鼻甲骨；D：颈前淋巴结；E：肠系膜淋巴结；F：尾根部A:Lip; B: Palate; C: Turbinate; D: Anterior cervical lymph node; E: Mesenteric lymph node; F: Root of tail

2.4 组织病毒载量

对阳性组织样品进行相对荧光定量PCR检测，发现阳性检出率均为100 %。羊传染性脓疱病毒在唇部、口腔上额、鼻甲骨、颈前淋巴结、肠系膜淋巴结、尾根部的含量(单位：2-△△Ct)分别为(17.59±0.14)、(22.73±0.1)、(24.41±1.9)、(2.75±0.16)、(0.15±0.02)、(19.29±0.51)，即在唇部、口腔上颚、尾根部的含量较高，在鼻甲骨的含量最高，在颈前淋巴结、肠系膜淋巴结的含量较低。

2.5 病毒增殖情况

将处理后的鼻甲骨和唇部痂皮病毒悬液接种OFTu细胞后，发现在48 h均开始出现少量细胞的变圆脱落，细胞间隙变宽，72 h出现明显的细胞病变，其中，鼻甲骨病毒悬液引起的细胞病变更为明显，而对照组未见细胞病变(图4)。盲传3代后，测定鼻甲骨源和唇部痂皮源病毒TCID50分别为10-4.1和10-5.8。

A. 对照(72 h)；B. 鼻甲骨病毒悬液(72 h)；C. 唇部痂皮病毒悬液(72 h)A. Control(72 hours); B. Virus suspension of nasal turbinate(72 hours); C. Virus suspension of lip epidermal(72 hours)

3 讨 论

羊传染性脓疱可引起山羊和绵羊的口唇部、乳房和尾根部等产生丘疹、水泡和疣状结痂，对羔羊危害较大，防控不及时，常导致继发感染，严重者导致死亡，威胁养羊业的健康发展。目前，国内尚无商品化羊传染性脓疱疫苗，因此对羊传染性脓疱疫苗候选毒株的研究十分关键。在羊传染性脓疱病毒分离纯化中，采集的样品多为口唇部痂皮组织[14-15]，样品受支原体、真菌和细菌等污染风险较大，若处理不当会给病毒在细胞上的增殖造成严重干扰。目前，关于羊传染性脓疱病毒的分离鉴定研究报道较多，但多数仅对痂皮组织中的病毒进行初步的细胞培养。笔者研究发现，山羊感染口疮病毒后常继发感染多动物链球菌、金黄色葡萄球菌和溶血性曼氏杆菌[16]，由于样品比较特殊，长期暴露于外界环境中，因此，残留在痂皮组织中的病原菌内毒素与外毒素可能对病毒的纯化培养造成干扰。本研究对攻毒后羔羊的不同组织器官进行病毒定位及载量分析，发现试验组羔羊唇部、上颚、鼻甲骨、肠系膜淋巴结、颈前淋巴结和尾根部均检出羊传染性脓疱病毒，而唇部、上颚、鼻甲骨和尾根部的病毒载量较高，其中，鼻甲骨病毒含量最高。综上所述，通过对攻毒后羊传染性脓疱病毒在羔羊体内的组织定位及病毒载量分析，首次明确了山羊传染性脓疱病毒可在在患病羔羊的多个组织中定殖，其在鼻甲骨中含量最高，且该组织中的病毒更易在OFTu细胞中增殖，为山羊传染性脓疱疫苗候选毒株的分离纯化及其致病机制的深入研究提供数据支撑。