同源重组修复蛋白RAD54B在肿瘤中的研究进展

邱世岳

肿瘤的发生与DNA损伤密切相关，DNA损伤的积累会导致原癌基因的激活和抑癌基因的失活。外源性因素(电离辐射)和内源性因素(炎症)可以产生多种类型的DNA损伤，包括碱基的修饰、DNA链的交联、单链及双链断裂。而在DNA损伤中，DNA双链断裂(double-stranded breaks, DSBs)是最严重的损伤形式。DSBs的错误修复会引起基因组不稳定，从而导致重大的染色体重排或断裂位点突变，甚至导致细胞死亡、细胞转化和肿瘤发生。同源重组修复(homologous recombination repair, HRR)是哺乳动物细胞最为精确的DNA损伤修复方式，而RAD54B蛋白是该通路重要的组成成分，该蛋白能保障损伤的DNA得到精确的修复，从而减少相关疾病或肿瘤的发生。基于HRR在肿瘤发生、发展及预后的重要性，而RAD54B在该通路中有不可或缺的作用，该文通过回顾性分析近年文献探讨RAD54B与肿瘤的关系。

1 RAD54B发现的起源及结构

Hiramoto等[1]在1999年首次报道SNF2超家族的一个新成员，即RAD54B基因。该基因与RAD54基因高度同源，其编码的蛋白在睾丸和脾脏中高表达，并且在减数分裂和有丝分裂重组中有着重要的作用。RAD54B基因位于人染色体8q21.3-q22区域。人原发性淋巴瘤和结肠癌中存在RAD54B基因高度保守位置的纯合突变，这提示RAD54B基因突变也许参与了肿瘤的发生。RAD54B编码的mRNA长度为3 074 kb，经过翻译和修饰后的蛋白质包含910个氨基酸，相对分子质量为10.3×104[2]。RAD54B蛋白中心区域的特征性解旋酶模体与RAD54的SNF2/SWI2家族蛋白高度同源，而氨基末端则仅前10个氨基酸具有同源性[3]。RAD54B蛋白包含3个结构域，(1)N末端区域：SWI2/SNF2家族结构域(aa 299-598)，该区域是ATP酶结构域的组成部分，能水解ATP释放能量，进而破坏蛋白质-DNA的相互作用[4-5]；(2)RAD54B的中央区域：为DEAD样解旋酶(DEXDc)结构域(aa321-462)，主要参与依赖于ATP的DNA重塑；(3)C末端区域：解旋酶超家族(HELICc)结构域(aa 636-766)，该结构域能利用来自核苷酸三磷酸水解的能量驱动蛋白沿着DNA移位[2]。此外，RAD54B还有5个ATP结合位点和3个核苷酸结合位点，这些位点与产生能量的水解反应密切相关。

2 RAD54B参与DSBs修复功能

RAD54B在HRR通路上与RAD54的功能相似，RAD54B与RAD51、RAD54及BRCA1形成蛋白复合体，进而调节RAD51蛋白介导的同源DNA链配对和同源DNA链入侵[6-8]。RAD54B蛋白在HRR的功能如下：(1)RAD54B蛋白是双链DNA依赖性ATP酶；(2)RAD54B蛋白具有DNA移位酶和DNA解旋酶活性；(3)RAD54B蛋白与RAD51蛋白相互作用，这种相互作用是具有功能性和高度特异性的；(4)RAD51蛋白刺激RAD54B蛋白的ATP酶活性，DNA转位酶活性和DNA解旋酶活性。相反，RAD54B蛋白刺激由RAD51蛋白参与的D环(同源重组中的关键中间体)的形成[9]。总而言之，RAD54B蛋白的主要功能是使用ATP水解产生的能量重塑蛋白质-双链DNA复合物，从而增强染色质的可近性。也有研究表明，同源重组时，在DSBs位点处的单链DNA(ssDNA)会形成核蛋白丝，而RAD54B蛋白可以稳定该核蛋白丝，从而刺激DMC1介导的DNA链交换[10]。事实上，由于精确的DSBs修复需要以染色质为模板，所以依赖于RAD54B蛋白的染色质重塑活性对HRR至关重要。

3 RAD54B与肿瘤的研究进展

3.1 RAD54B在肿瘤细胞系的研究进展有研究证实，HRR通路中RAD51、BRCA1等蛋白与乳腺、消化道肿瘤的发生及预后密切相关[11-12]。自从发现RAD54B参与DSBs修复以来，学者们不断探索RAD54B与肿瘤发生、发展及预后的关系。至少在12种不同类型癌症中检测到RAD54B拷贝数变异(扩增和缺失)，单核苷酸多态性(错义和无义)以及mRNA表达变化，这提示RAD54B基因和蛋白的改变与肿瘤的发生相关[13]。Wesoly等[14]实验发现，RAD54B缺陷鼠胚胎干细胞对电离辐射的敏感性比对照组高1.5倍，这表明RAD54B有助于维持基因组的稳定性。基于细胞中RAD54B蛋白表达缺陷会降低染色体靶向整合的报道，人们对RAD54B蛋白在HHR通路中的潜在作用有了初步了解。

有研究发现，敲除或敲低细胞中RAD54B表达能诱导染色体不稳定(CIN)，而在RAD54B缺陷细胞中重新引入RAD54B则减少了CIN(非整倍体)，这表明RAD54B缺失可能是癌症发生、发展的致病事件[15-17]。也有研究发现ATM和RAD54的失活并未增加细胞对红外线照射的敏感性，而ATM、RAD54和RAD54B的三突变体则表现出显著的红外超敏反应[18]。暴露于不同的染色体断裂剂中，RAD54/RAD54B缺陷细胞具有更高敏感性，并且其突变频率比野生型鼠胚胎成纤维细胞和精原细胞的突变频率高[19-20]。McAndrew等[21]通过对不同肿瘤测序结果的分析发现，在人乳腺癌、肝癌和膀胱癌等癌症组织中，存在不同频率和不同类型的RAD54B基因的有害变异。上述研究结果表明，RAD54B在癌症的发生、发展中起到一定的作用。

3.2 RAD54B在肿瘤组织的研究进展

3.2.1结直肠癌 Sajesh等[22]通过siRNA沉默和化学抑制SOD1的方式来选择性杀死RAD54B缺陷的HCT116细胞，并进一步证实这种相互作用在不相关的细胞类型中是保守的，而抑制SOD1后产生的DSBs在RAD54B缺陷细胞中持续存在并且导致细胞死亡。尽管只有3.3%的散发性结直肠癌有RAD54B基因的体细胞突变，但该基因的突变或缺失在淋巴瘤、肾、前列腺、脑和乳腺癌中也同样存在。因此，作者认为抑制SOD1也许可以治疗RAD54B缺陷的其他类型肿瘤。

Nagai等[23]在108例Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌中发现，与RAD54B蛋白低表达组相比，RAD54B蛋白高表达组患者的远期无复发生存率更低。Cox比例风险模型的多变量分析表明，RAD54B蛋白高表达是Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者远期复发的独立危险因素。RAD51也是HRR通路中的关键成分，其表达与癌症的预后关系仍存在争议。有文献报道RAD51过表达与各种癌症的不良预后相关，如肺非小细胞癌、乳腺癌、食管鳞状细胞癌和结直肠癌等。但在另外两份研究中却有着相反的结论，显示在胶质瘤和乳腺癌中，RAD51高表达则有着较好的预后。作者在结直肠癌的研究中也分析了RAD51表达，尽管RAD51在癌组织中的表达高于正常黏膜，但结果显示RAD51的表达模式并不能预测结直肠癌患者的预后。作者的实验结果与先前的研究结果相矛盾，这可能是因为实验方法不同所致。在该实验中作者采用的是Real-time PCR法检测RAD51表达，而以往多数实验采用的是免疫组化法。另外，RAD54B和RAD51的表达与结直肠癌患者的临床预后不一致，可能是HRR以外的其他通路导致的，因为RAD54B除参与HRR通路，其还可以通过MDM2-MDMX泛素连接酶复合物来增加p53蛋白的降解。由于实验的局限性，RAD54B在结直肠癌中的临床用途仍有待进一步探讨。

3.2.2肺腺癌 Hwang等[24]使用免疫组化法在93例肺腺癌中对24对配对基因进行研究，并应用Kaplan-Meier分析和Cox比例风险模型来评估它们的预后作用。结果显示，在预后不良的肺腺癌患者中，只有FEN1蛋白和RAD54B蛋白高表达，并且FEN1蛋白和RAD54B蛋白同时表达的患者容易出现晚期淋巴结受累和预后不良。上述结果提示，对于同时表达FEN1和RAD54B的患者，加强随访和靶向治疗可能会改善患者的临床预后。在24对预测的合成致死基因对中，Chang等[25]通过免疫组化染色，发现了四种表达模式可以作为131例亚洲肺腺癌患者的不良预后标记。这四种表达模式分别是RAD54B表达上调，BRCA1表达下调同时RAD54B表达上调，FEN1表达上调或不变且RAD54B表达上调，PARP1和RAD54B同时表达上调。除了BRCA1表达下调同时RAD54B表达上调的这一预后标记外，其余3个预后标记在3个独立的基因表达数据库中均得到了进一步证实。

Xu等[26]通过对15例肺腺癌组织和对应癌旁正常肺组织行Real-time PCR、免疫组化和Western blot实验，结果发现RAD54B在癌组织中的表达显著高于对应癌旁正常肺组织。与此同时，通过向肺癌细胞系A549转导携带shRAD54B的慢病毒，结果显示，与对照组相比，实验组RAD54B表达显著减少。抑制A549的RAD54B表达能减少细胞增殖、降低Caspase 3/7的活性以及促进该细胞的凋亡。这些实验结果提示，RAD54B在肺癌细胞增殖中发挥着致癌作用。

由于研究的样本量、病例来源以及患者随访期等的局限性，RAD54B等蛋白表达对肺腺癌生存率的长期影响尚不清楚。因此，今后还需进一步更完整的研究来验证RAD54B表达与肺腺癌临床预后及靶向治疗之间的关系。

3.2.3肝癌 Wang等[27]研究发现，相较于正常肝细胞系LO2，RAD54B在肝癌细胞系中有更高的表达。同样的，在肝癌组织中，RAD54B蛋白高表达也许与肝癌患者的不良预后相关。另外，RAD54B蛋白表达下调能显著抑制细胞增殖和群落形成，并且能诱导G1/S细胞周期阻滞和细胞凋亡。这些结果提示，RAD54B有致癌特性，同时也可能是肝癌患者的潜在治疗靶点。

3.2.4乳腺癌 Zhang等[28]通过对多个相关数据库的生物信息学分析以及通过免疫组化和乳腺癌细胞系等相关实验，探讨乳腺癌中RAD54B的表达情况及其与乳腺癌发生、发展和预后的关系。结果发现，乳腺癌组织中RAD54B蛋白表达高于癌旁正常组织。在Luminal A型乳腺癌中，RAD54B高表达提示患者预后不良。并且，在细胞系实验和动物实验中发现RAD54B过表达能促进乳腺癌细胞增殖，而RAD54B表达下调则会抑制该亚型乳腺癌的生长。这些实验结果提示，RAD54B表达或许可以为Luminal A型乳腺癌患者提供精准的激素治疗方案。

上述研究虽然未能阐明RAD54B参与癌症形成的机制，但这些实验结果提示，RAD54B有可能作为临床上用于治疗癌症的新靶标。

4 结语

综上所述，HRR作为DSBs最为精确的修复方式，能高度维持DNA的保真度，因此，正常的HRR对于维持细胞乃至机体生理功能至关重要。在HRR的关键步骤中，RAD54B蛋白作为RAD51蛋白的辅助因子，能协助RAD51蛋白介导的DNA链入侵，所以RAD54B蛋白表达异常会影响断裂DNA链的修复，进而影响基因组的稳定性。因此检测癌组织中的RAD54B蛋白表达，对于了解该肿瘤的癌变机制和对肿瘤的预后判断及治疗方案有参考价值。