灵芝孢子粉破壁前后质量对比研究

王方，麻红太，胡德，郑淑晶，王淑敏※

（1.长春中医药大学吉林省菌物药生物技术工程实验室，吉林 长春 130117；2.吉林省人事考试中心，吉林 长春 130022）

灵芝孢子粉（Ganoderma Lucidum Spores）为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝〔Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.〕或紫芝（Ganoderma sinense Zhao,xu et Zhang）的干燥成熟孢子[1]，是一种极微小的卵形生殖细胞。灵芝孢子粉具有灵芝全部的遗传物质，且有效成分含量相比于灵芝母体更高[2]，研究证明灵芝孢子粉中含有多糖、三萜[3]、蛋白质、核酸[1]等成分，临床上多用于抗肿瘤[4]、安神、抗氧化[5]、增强机体免疫力[6]等方面，是一种极为重要的药食两用真菌。

近年来，探讨破壁灵芝孢子粉的药理作用及部分化学成分含量的研究较多，但鲜有对破壁前后灵芝孢子粉质量进行对比的报道。灵芝孢子粉作为目前市面上最受欢迎的保健食品之一，其药用价值毋庸置疑，市场需求量大且价格昂贵，但质量良莠不齐，存在掺伪及造假现象[7]，目前各版药典及吉林省药材标准暂无收载灵芝孢子粉的相关质量标准，笔者探究灵芝孢子粉破壁前后的质量差异，以期为指导灵芝孢子粉的规范化生产和临床应用提供理论依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

试验所用10 批破壁灵芝孢子粉（P1～P10）和未破壁灵芝孢子粉（W1～W10）药材均购于吉林省仙草医药药材有限公司，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为多孔菌科真菌赤芝（G lucidum）的干燥成熟孢子。

1.2 仪器

YYS-100E 型生物显微镜（上海圆仪光学仪器有限公司）；XL-30 ESEM环境扫描电子显微镜（美国FEI公司）；KQ-500DA 型数控超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；AUY-220 分析天平、AA-6880 原子吸收分光光度计、UV-2450 紫外-可见分光光度计（日本岛津有限公司）；GZX-9140MBE 型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）；MC02810218 马弗炉（余姚金电仪表有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅两列三孔（常州市江南实验仪器厂）；KDM 型调温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）；PF-25原子荧光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；TGL 16M 台式高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；AS 3120A超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.3 试剂

破壁灵芝孢子粉对照品购自中国食品药品检定研究院（批号：121701-201401）；无水葡萄糖（天津市光复精细化工研究所，批号：20140221）；齐墩果酸（上海源叶生物科技有限公司，批号：HA0820KA14）；乙醇、硫酸、冰醋酸、高氯酸等均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 炮制方法

取成熟的未破壁孢子粉，去除杂质，采用破壁机机械法破壁，干燥，即得。

2.2 性状鉴别

未破壁灵芝孢子粉呈浅棕色，较干燥，质地极轻，手捻之有滑腻感，无特殊气味；

破壁灵芝孢子粉呈深褐色，有潮湿感，偶有结块，指触即散，气微，味微苦。

2.3 显微鉴别

光学显微图见图1～2，电子显微图见图3～4。

图1 光学显微镜下破壁孢子粉（x40）Fig.1 The broken spore powder under optical microscope(x40)

图2 光学显微镜下未破壁孢子粉（x40）Fig.2 The unbroken spore powder under optical microscope(x40)

图3 电子显微镜下破壁灵芝孢子粉（x5 000）Fig.3 The broken G.lucidumspore powder unde electron microscope（x5 000）

图4 电子显微镜下未破壁灵芝孢子粉（x5 000）Fig.4 The unbroken G.lucidumspore powder unde electron microscope（x5 000）

2.4 TLC鉴别

分别取供试样品粉末各2 g，加乙醇30 mL，加热回流30 min，过滤后蒸干滤液，残渣用2 mL甲醇溶解，即得供试品溶液。取灵芝孢子对照品溶液1 g，同法制得对照品溶液。参照2015年版《中国药典》四部通则0502 薄层色谱项下方法，吸取对照品溶液和供试品溶液各4L，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干后置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（图5）。

图5 灵芝孢子粉薄层色谱图Fig.5 Thin layer chromatogram of G.lucidumspore powder

2.5 水分测定

参考2015年版《中国药典》四部通则0832 项下方法，分别测定10 批次破壁和未破壁孢子粉水分，结果见表1。

2.6 总灰分测定

参考2015年版《中国药典》四部通则2302 项下方法，分别测定10 批次破壁和未破壁灵芝孢子粉总灰分及酸不溶性灰分含量，结果见表1。

2.7 浸出物测定

参考2015年版《中国药典》四部通则2201 项下热浸法，以水为溶剂，分别测定10 批破壁和未破壁灵芝孢子粉浸出物的含量，结果见表1。

表1 10 批破壁与未破壁孢子粉水分、灰分和浸出物含量Table 1 Contents of water,ash and extract in 10 batches of broken and unbroken spore powder （%）

续表1 （%）

2.8 重金属含量测定

2.8.1 供试品溶液的制备 分别精密称取供试样品0.3 g，置四乙烯消解罐内，加硝酸10 mL，混匀，浸泡过夜，盖好内盖，旋紧外套，置于微波消解炉内消解后（消解程序：0～5 min 100 ℃、5～8 min 100 ℃、8～13 min 150℃、13～16 min 150 ℃、16～21 min 190 ℃、21～51 min 190 ℃），取出消解内罐置于电热板上，在120 ℃下缓缓加热至红棕色蒸气挥尽，并浓缩至2～3 mL，放冷，转入25 mL 量瓶中，用超纯水洗涤容器，洗液合并于量瓶中，并稀释至刻度，摇匀备用。同时按上述方法制备空白溶液。

2.8.2 标准贮备溶液的制备 分别精密吸取铜、铅、镉、砷、汞标准溶液适量置于100 mL 容量瓶中，用2%的硝酸稀释成铜含量为10g/mL，铅、镉、砷、汞含量分别为1g/mL标准贮备液，于0～5℃条件下贮存备用。

2.8.3 标准曲线的绘制及回归方程的建立 精密吸取铜、铅、镉、砷、汞标准贮备液适量，分别置于25 mL 容量瓶中，加入2%硝酸溶液，制备成含铜分别为0、0.05、0.20、0.40、0.60、0.80g/mL，含汞分别为0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 ng/mL，含砷分别为 0、5、10、20、30、40 ng/mL，含铅分别为 0、5、20、40、60、80 ng/mL，含镉分别为0、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0 ng/mL的溶液，测定吸光值，以浓度（x）为横坐标，以对应的吸光值（y）为纵坐标，绘制出相应的标准曲线，以此建立铜元素的线性回归方程为 y铜=0.175 11x铜+0.000 331 31，r铜=0.999 9；汞元素的线性回归方程为y汞=1 664.323 8x汞+8.151 3，r汞=0.999 5；砷元素的线性回归方程为y砷=158.366 1 x砷+10.055 0，r砷=0.999 3；铅元素的线性回归方程为 y铅=0.003 926 4x铅+0.020 903，r铅=0.999 6；镉元素的线性回归方程为y镉=0.058 771x镉+0.008 584 4，r镉=0.999 3。

2.8.4 重金属检测结果 参考《中国药典》2015年版第四部通则2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法第一法——原子吸收分光光度法进行检测。结果见表2。

表2 10 批次破壁与未破壁孢子粉重金属含量Table 2 Contents of heavy metals in 10 batches of broken and unbroken spore powder （mg/kg）

续表2 （mg/kg）

2.9 多糖含量测定

2.9.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，加水配制成含量0.122 mg/mL的溶液，混匀备用。

2.9.2 供试品溶液的制备 精密称定破壁与未破壁灵芝孢子粉各2 g，分别置于500 mL 圆底烧瓶中，并加超纯水60 mL，静置1 h 后加热回流4 h，趁热过滤，将滤渣与滤纸置入烧瓶中，再加超纯水60 mL，加热回流3 h，趁热过滤，合并2 次滤液，置水浴上蒸干，残渣溶于5 mL 水中，缓缓加入70 mL 乙醇，摇匀，在4 ℃放置12 h，离心，弃上清，沉淀物用热水溶解并转移至50 mL 量瓶中，放冷，以水为溶剂，定容至刻度，摇匀，取适量溶液，离心，精密吸取上清液3 mL，置于25 mL量瓶中，加水至刻度摇匀备用。

2.9.3 波长的选择 精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2 mL，分别置15 mL具塞试管中，各加水至2 mL，迅速加入新配制的硫酸蒽酮溶液6mL，摇匀，静置15min后，立即置冰水浴中冷却15 min，取出，空白溶液校正，利用紫外-可见分光光度计于400～800 nm波长内进行扫描，根据试验结果，对照品和供试品溶液在624 nm波长处有最大吸收，故选择624 nm 作为试验波长。

2.9.4 回归方程的建立 精密吸取对照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置15 mL具塞试管中，各加水至2 mL，迅速加入新配制的硫酸蒽酮溶液6 mL，摇匀，静置15min后，立即置冰水浴中冷却15min，取出，空白溶液校正，于624 nm 波长下测定吸光值，以吸光值（A糖）为纵坐标，浓度（C糖）为横坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为 A糖=0.065 3C糖0.104 3，r糖=0.999 8，无水葡萄糖在0.048 8～0.097 6 mg 线性关系良好。

2.9.5 精密度 精密吸取对照品溶液1.0mL，置15mL具塞试管中，各加水至2 mL，按“2.9.4”项下方法连续6 次测定其吸光值，其RSD为0.04%，表明仪器精密度良好。

2.9.6 重复性 精密吸取2 mL同一批号供试品溶液6 份，分别置15 mL具塞试管中加水至2 mL，按“2.9.4”项下方法测定吸光值，计算灵芝多糖含量。其RSD 为1.15%，表明重复性良好。

2.9.7 稳定性 精密吸取同一供试品溶液 1.0，按“2.9.4”项下方法，分别测定0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 min 时的吸光值，其 RSD 为 0.87%，表明供试品溶液在60 min 内能保持良好的稳定性。

2.9.8 加样回收率 分别精密称取6 份已知含量的同一批号样品2 g，加入500 mL 圆底烧瓶中，分别精密加入105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖30 mg，按“2.9.4”项下的方法测定吸光值。计算其平均回收率（101.73%）符合2015年版《中国药典》所规定的92%～105%范围，说明该方法精确度较高。其加样回收率结果见表3。

表3 加样回收率Table 3 Recovery rate of added samples

2.9.9 多糖含量测定 精密称取10 批次破壁和未破壁灵芝孢子粉样品各2 g，分别按“2.9.2”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.9.4”项下方法测定吸光度，计算灵芝孢子粉的多糖含量。结果见表4。

表4 孢子粉多糖和总三萜含量Table 4 Polysaccharides and total triterpene contents of spore power

2.10 总三萜含量测定

2.10.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成0.2 mg/mL 溶液，混匀备用。

2.10.2 供试品溶液的制备 精密称取破壁和未破壁灵芝孢子粉各2 g，置于具塞锥形瓶中，并入95%乙醇50 mL，超声45 min，过滤，滤液置100 mL量瓶中，用适量95%乙醇洗涤滤器和滤渣，并定容至刻度，摇匀备用。

2.10.3 波长的选择 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各0.2 mL，分别置15 mL 具塞试管中，水浴挥干，放冷，精密加入新配制香草醛-冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8 mL，摇匀，70 ℃水浴15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出后精密加入乙酸乙酯4 mL，空白溶液校正，利用紫外-可见分光光度计于400～800 nm 波长内进行扫描，根据试验结果，对照品和供试品溶液在548 nm 波长处有最大吸收，故选择548nm 作为试验波长。

2.10.4 回归方程的建立 精密吸取对照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分别置15 mL具塞试管中，水浴挥干，放冷，精密加入新配制香草醛-冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8 mL，摇匀，70 ℃水浴15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出后精密加入乙酸乙酯4 mL，空白溶液校正于548 nm 波长下测定吸光值，以吸光值（A齐）为纵坐标，浓度（C齐）为横坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为 A齐=0.035 2 C齐0.103 8，r齐=0.999 6，齐墩果酸在0.02～0.14 mg 线性关系良好。

2.10.5 精密度 精密吸取同一对照品溶液1.0 mL，按“2.10.4”项下方法连续6 次测定其吸光值，其RSD为0.17%，表明仪器精密度良好。

2.10.6 重复性 精密称取同一批号样品 6 份，按“2.10.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液2 mL，置15 mL具塞试管中，按“2.10.4”项下方法测定其吸光值，计算总三萜含量，其RSD 为1.56%，表明重复性良好。

2.10.7 稳定性 精密吸取同一供试品溶液1.0 mL，按“2.10.4”项下方法分别测定其在 0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 min 时的吸光值，其 RSD 为 0.57%。表明供试品溶液在60 min 内能保持良好的稳定性。

2.10.8 加样回收率 分别精密称取0.5 g已知含量的同一批号样品6 份，分别置于具塞锥形瓶中，分别精密加入齐墩果酸标品约3 mg，按“2.10.4”项下方法测定其吸光值。计算总三萜加样回收率（99.94%），符合2015年版《中国药典》所规定范围（92%～105%），说明该方法精确度较高。加样回收率结果见表5。

2.10.9 总三萜含量测定 分别精密称取10 批次破壁与未破壁灵芝孢子粉样品2.0g，按“2.10.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.10.4”项下方法测定吸光值，计算破壁、未破壁灵芝孢子粉的总三萜含量。结果见表4。

表5 总三萜加样回收率Table 5 Recovery rate of total triterpenoid added sample

3 讨论

本研究通过对10 批破壁与未破壁灵芝孢子粉外观性状、显微鉴别、理化鉴别等方面进行评价，全面探究破壁与未破壁灵芝孢子粉质量差异。

由试验结果可以得出，对破壁与未破壁灵芝孢子粉鉴别可从以下3 个方面入手：①外观性状。灵芝孢子粉破壁后颜色加深，由未破壁时的浅棕变为深褐色，未破壁孢子粉体轻，有滑腻感，破壁孢子粉体略重，有潮湿感。②显微观察。破壁灵芝孢子粉呈不规则碎片状，大小不一，可见散落的孢子碎片与内容物；未破壁灵芝孢子粉呈完整卵形，顶端平截，内壁有疣状突起。③理化鉴别。薄层色谱结果显示，破壁与未破壁灵芝孢子粉在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点。

破壁与未破壁灵芝孢子粉水分平均含量分别为8.16%、10.77%，破壁灵芝孢子粉水分略低于未破壁灵芝孢子粉，原因可能为未破壁孢子粉外壁是由具有较强亲水性的葡聚糖构成，破壁后的孢子粉有疏水的孢子油析出，阻碍葡聚糖对水分的吸收，相同质量下的2种孢子粉，未破壁孢子粉含水量更高。破壁与未破壁孢子粉总灰分平均含量为0.87%、0.64%，酸不溶性灰分平均含量为0.31%、0.16%，破壁孢子粉总灰分与酸不溶性灰分含量高于未破壁孢子粉，其原因主要是孢子粉破壁过程中，某些化学成分发生改变，不易灰化，但使破壁孢子粉不易灰化的成分及原因尚不清楚。破壁与未破壁孢子粉浸出物平均含量为5.86%、7.48%，可能原因是灵芝孢子粉破壁后，有疏水性孢子油溶出，阻碍灵芝孢子粉中内容物的浸出。相同质量下，未破壁孢子粉浸出物含量大于破壁孢子粉。在测定的5 种重金属含量中，破壁与未破壁孢子粉结果无较大差异，证明灵芝孢子粉破壁过程对重金属含量无影响。

临床实践证明，多糖与总三萜是灵芝孢子粉中的主要活性物质，起到抗肿瘤、安神、增强机体免疫力等作用。本研究结果显示，破壁后的灵芝孢子粉多糖平均含量（1.54%）和总三萜平均含量（4.22%）均高于未破壁灵芝孢子粉多糖与总三萜平均含量（0.99%、2.32%）。

综合试验结果来看，破壁后的灵芝孢子粉比未破壁孢子粉能够释放更多的有效成分，更利于人体吸收，因此认为破壁灵芝孢子粉优于未破壁灵芝孢子粉。但破壁后的灵芝孢子粉产生的孢子油，若长时间暴露在空气中，极易氧化变质，使孢子油酸价变高，产生异味，影响孢子粉的保健效果及口感。因此灵芝孢子粉应注意使用独立包装，并在阴凉通风处保存。