miR-219靶基因HLA-G与胚胎停止发育相关性研究

张莹 王敏 李江红

【摘 要】目的：探讨miRNA219靶基因HLA-G在胚胎停止发育中的表达及意义。方法：应用免疫組化LDP法以及Envision〔TM〕系统（K4001）（Dako公司产品）检测135例胚胎停育妇女（实验组）及65例正常早孕人工流产妇女（对照组）绒毛组织中的HLA-G。结果：我们发现在胚胎停育绒毛组织中，HLA-G低表达。而在正常流产绒毛组织中，HLA-G高表达。通过荧光素酶活性检测、细胞转染、组织芯片免疫组化检测通过上调miR-219的水平，能够在24h内迅速降低HLA-G的表达。结论：本研究通过对200例绒毛组织中的HLA一G蛋白的检测，证实了在绒毛组织中，HLA-G起着关键的作用。观察发现，miR-219和HLA-G的表达之间成负相关。

【关键词】miRNA219HLA-G;表达负相关胚胎停止发育

【中图分类号】R714【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2020）01--02

人类白细胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）是1987年首次克隆出来的位于6号染色体短臂的一类免疫耐受分子[1]，具有选择性组织分布的特点，其选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞，而此处恰恰不表达经典的HLA-A，B分子及DR，DQ和DP分子.在绒毛膜外细胞滋养层细胞，包括那些侵入子宫蜕膜的细胞滋养层细胞中HLA-G高表达;而在胎盘绒毛的合体滋养层中，HLA-G表达水平较低.绒毛膜细胞滋养层与绒毛膜外细胞滋养层的分化伴随着细胞表面HLA-G分子表达水平的提高。

胚胎停止发育又称稽留流产，是指胎儿或者胚胎组织已死亡滞留宫腔内未能及时自然排出者，表现为有或无任何症状，早孕的反应消失，子宫不再增大反而缩小。B型超声检查提示妊娠囊形态异常，无胎心搏动[2]。导致胚胎停止发育的原因十分复杂，目前已知的病因中有遗传因素、生殖道结构异常、内分泌失调，细胞增殖和凋亡的失衡，免疫功能异常，全身感染性疾病、强烈应激与不良习惯，环境污染、食品安全、辐射和长期暴露于有毒化学物质环境以及孕妇高龄等[3]。但仍有超过50% 的胚胎停止发育原因不明。随着二胎政策放开，近几年来临床工作中胚胎停止发育的发生及发展呈不断上升的趋势，目前迫切需要寻找与之密切相关的诊断位点对于其临床诊断和治疗有着十分重要的意义。

近年来研究[4]提示，miRNA 在稽留流产的发生机制中发挥重要作用。而且有大量的研究表明[5，6]，在胚胎干细胞、着床后胚胎等过程中均有 mi RNA 的表达，例如R-125a，miR-295，miR-181b及miR-219等等都与胚胎发育有关。前期我们曾应用：RT-PCR检测表明 ，胚停育组miRNA219表达明显高于对照组.为此，我们进一步研究了miRNA-219在稽留流产中的表达和功能、相关靶基因以了解其之间的相关性。

我们通过TargetScan软件对miR-219靶基因进行预测，并结合一些文献查阅，在多个潜在的靶基因中选取了HLA-G进行定量PCR检测。

在进一步的研究中，我们旨在调查 HLA-G在临床胚胎停止发育的绒毛组织和正常流产的绒毛组织中的表达水平，进而进一步检测胚胎停止发育患者绒毛组织中miRNA219的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 方法

实验组：选取2016年7月至2017年7月于潍坊市妇幼保健院产科及计划生育科就诊的135例胚胎停止发育（年龄24～46岁，年龄中位数为34.3岁）的患者，孕7～12周， 平均孕10周， 既往身体健康， 无子宫肌瘤、卵巢囊肿、子宫形态异常、慢性感染等生殖器官疾病。胚停育的诊断标准：B超提示（1）妊娠囊不增长、变形， 轮廓模糊， 小于妊娠月份;（2）胚芽枯萎缩小或无心血管搏动[7]， 经1周后复查无改变。

对照组：同期随机抽取孕7～12周要求人工流产者65例，年龄21～44岁， 平均32.2岁， 既往无不良孕产史， 无其他妇产科合并症。见表1。

两组孕妇在年龄、孕周、生育史等方面比较，差异无统计学意义（P >0.05），具有可比性。

1.2 标本采集

实验组和对照组均采用负压吸宫法， 无菌操作取部分绒毛，用免疫组化LDP法以及Envision〔TM〕系统（K4001）（Dako公司产品）分别从胎停育绒毛组织和正常绒毛组织中提取HLA-G，以观察其在两组中的表达情况。

1.3 统计分析

使用 SPSS 统计软件包（IBM SPSS Statistics数据编辑器19）进行统计分析。计量资料以  表示，两组间比较采用 t 检验，多组间采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

我们发现在胚胎停育绒毛组织中，HLA-G低表达。而在正常流产绒毛组织中，HLA-G高表达。前期我们进行了miR219在两组组织中的研究，发现在胚胎停育组miR219高表达。通过荧光素酶活性检测、细胞转染、组织芯片免疫组化检测通过上调 miR-219的水平，能够在24h 内迅速降低HLA-G的表达，这说明 miR-219对 HLA-G 有着明显的调控作用。

讨论

本研究通过对200例绒毛组织中的HLA-G蛋白的检测，证实了在绒毛组织中，HLA-G起着关键的作用。观察发现，miR-219和HLA-G的表达之间成负相关。HLA-G作为一种非经典 HLA-I 类分子，在母-胎免疫耐受及维持正常妊娠中起重要的免疫调节作用[8-9]。HLA-G 分子主要存在于绒毛远端的细胞滋养层。其通过与免疫活性细胞（如杀伤性 T 细胞、NK 细胞等）和有关因子如 IL-2等发生作用，阻断母体对胎儿的免疫应答，保护妊娠顺利进行。在胚胎着床期间，子宫蜕膜有大量浸润的免疫活性细胞，其中大多数是 NK 细胞，而HLA-G 能抑制 NK 细胞的杀伤活性。因此，HLA-G 的减少可能使滋养细胞易受母体免疫系统攻击，影响着床和妊娠维持，从而导致妊娠的失败。通过我们的研究，我们希望揭示miR-219在临床应用方面的价值。我们的研究将为设计针对miR-219的靶向药物提供充分、可靠的理论依据，为解决患者今后的胚胎质量提供新思路，以达到优生优育的目的。

Lee RC， Feinbaum RL， Ambros V.The C.elegans helerochronic gene lin-4encods small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell，1993，75（5）：843-854.

谢幸、苟文丽。第八版妇产科学（49）

谢幸、苟文丽。第八版妇产科学（47-48）

TakadaS，BerezikovE，YamashitaY，Lagos-QuintanaM， Kloosterman WP，Enomoto M， Hatanaka H， Fujiwara S， atanabe H， Soda M， Choi YL， Plasterk RH，Cuppen E， Mano H.Mouse micro RNA profiles determined with a new and sensitive cloning method.Nucleic Acids Res.2006;34（17）： e115.

Mineno J， Okamoto S， Ando T， Sato M， Chono H， Izu H， Takayama M， Asada K，Mirochnitchenko O， Inouye M， Kato I.The expression profile of micro RNAs in mouse embryos.Nucleic Acids Res.2006Mar31;34（6）：1765-1771

Weston MD， Pierce ML， Rocha-Sanchez S， Beisel KW， Soukup GA.Micro RNA gene expression in the mouse inner ear.Brain Res.2006Sep21;1111（1）：95-104.

李秀芳.婦产科超声诊断学[ M].西安：世界图书出版公司，2002：115

Mayor-Lynn K，Toloubeydokhti T，Cruz AC，et al.Expression pro-file of microRNAs and mRNAs in human placentas from pregnanciescomplicated by preeclampsia and preterm labor[J]. Reprod Sci，2011，18（1）：46-56.

Wang X，Li B，Wang J，et al.Evidence that miR-133a causes re-current spontaneous abortion by reducing HLA-G expression[J].Reprod Biomed Online，2012，25（4）：415-424.