东方绢金龟雌成虫对桃树挥发物的触角电位和行为反应

张萌萌, 陈宏灏, 王文凯, 陈 立

(1.宁夏农林科学院植物保护研究所, 银川750002; 2.长江大学农学院, 湖北荆州 434000;3.中国科学院动物研究所, 农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室, 北京100101;4.河北大学生命科学学院, 生命科学与绿色发展研究院, 河北保定 071002)

东方绢金龟Maladeraorientalis，又名黑绒金龟、天鹅绒金龟子、东方金龟子等，属鞘翅目(Coleoptera)鳃金龟科(Scarabaeidae)，是重要的农林害虫(刘广瑞等, 1997; 乔志文等, 2014)，主要分布于我国华北、东北和西北地区，以及朝鲜、日本和蒙古(乔志文等, 2014; 师二帅, 2014)。东方绢金龟一年发生1代，以成虫在土中越冬，越冬成虫在4月上旬开始出土直至6月末，4月末至6月上旬为成虫为害盛期(白文辉, 1981)。该虫适应性强，食性杂，可为害149种植物，分属于45科116属(刘广瑞等, 1997)。成虫喜食豆类、甜菜和林木、果树的嫩芽、幼苗(贺达汉等, 2000; 陈博和陈磊, 2016)，幼虫则对农作物及苗木根系造成严重危害(韩国君等, 2002)。成虫有假死性和趋光性，多在傍晚出土活动，约在17时出土取食，18-20时数量最多(乔志文等, 2014)。目前，防治东方绢金龟的主要方法包括振落捕杀、黑光灯诱杀、喷洒农药以及利用白僵菌Beauveria制剂、TS1线虫、苏云金杆菌Bacillusthuringiensis制剂处理土壤等(胡长林和李莉, 2002; 贺晓红, 2004; 孙瑞红等, 2008; 马庆州等, 2009; 许玉国和孙久胜, 2012; 周兴武和丁广州, 2012)。但是这些方法存在费时费力、污染环境、靶标害虫选择性差、防治效果有限等弊端，因此探索高效、环境相容性好的防治方法是害虫治理的上策。植物源引诱剂具有省力、高效、环境安全、害虫不易产生抗性等特点(李为争等, 2013; 滕小慧等, 2017)，有可能成为防治金龟甲类害虫的一个重要途径(龚恒亮等, 2013)。

植物挥发性物质在昆虫-植物关系中起着重要的作用，寄主植物可通过自身释放的挥发性物质影响昆虫的取食与产卵行为，而植食性昆虫则能利用寄主植物和非寄主植物释放的化学物质来识别、定位寄主(Knolhoff and Heckel, 2014; Sunetal., 2014)。例如，六月金龟Phyllophagacuyabana偏好取食大豆，在大豆田的产卵量显著高于棉花田，说明金龟甲成虫能够利用植物挥发物选择更适宜后代生存的寄主(Oliveiraetal., 2007)；白星花金龟Potosiabrevitarsis和小青花金龟Oxycetoniajucunda能够利用玫瑰花挥发物中的顺-3-己烯醇进行寄主定位(李仲秀等, 1995; 王广利和孙凡, 2005)；蒲公英花挥发物中的顺-3-己烯醇乙酸酯、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、苯甲酸苯酯可引起扁绿异丽金龟Anomalaoctiescostata的强烈趋向行为(Lealetal., 1994)；丙酸苯乙酯、丁子香酚和香叶醇(3∶7∶3, v/v)的混合物对日本丽金龟Popilliajaponica的引诱效果最佳，已被广泛应用于诱杀与监测(Leal, 1998)。

桃树是多种金龟甲的寄主植物，一株树上可有十几头甚至几十头金龟子集中取食，轻者吃成花叶，重者只残留叶脉，被为害的桃树会推迟结果甚至形成小老树以至枯死(浑志英和张之新, 1992; 李娅娅等, 2018)。本研究根据金龟子成虫利用植物挥发物进行寄主定位的行为特点，通过动态顶空吸附法收集桃树枝叶挥发物，采用气相色谱触角电位(GC-EAD)和气质联用(GC-MS)技术鉴定挥发物中对东方绢金龟具有触角电生理活性的化学物质，并对这些物质的行为活性进行测试，期望为开发高效、环保的东方绢金龟植物源引诱剂提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料和仪器

1.1.1供试昆虫：东方绢金龟雌成虫，采集于北京市朝阳区中国科学院奥运村园区内，用桃树叶饲养。

1.1.2供试植物：选取北京市朝阳区中国科学院奥运村园区内的桃树作为供试植物。

1.1.3主要试剂与仪器：采样袋(60 cm×80 cm, Reynolds Oven Bag，美国)；吸附剂Porapak Q(80-100目，Supelco，美国)；吸附管(内径5 mm)；大气采样仪QC-1S型(北京市劳动保护科学研究所，北京)；触角电位仪(Syntech, Kirchzarten，德国)；气相色谱-质谱联用仪(7890A-5975C, Agilent Technology，美国)；气相色谱仪(GC-2010plus, Shimaduz，日本)。色谱纯正己烷、二氯甲烷购自上海安谱科学仪器有限公司；供试挥发性气味物质的编号、标准化合物名称、相对分子质量和纯度见表1，均购自北京百灵威科技有限公司。

1.2 寄主植物桃树的选取和挥发物收集

在中国科学院奥运村园区内，选取5棵桃树，每棵树重复2次，在东方绢金龟出土高峰段(18∶00-20∶00时)采集桃树挥发物。参考李娅娅等(2018)的动态顶空吸附法，选取等量无病害且长势良好的枝条，用采样袋将枝条套住。然后在枝条基部放入装有活性炭的玻璃管(长20 cm，内径5 cm)，用绳子将采样袋连同枝条和玻璃管绑紧，在袋子顶端剪开一小口插入吸附管，用线绳绑紧，保证枝条完整且采样袋不漏气，用Teflon管依次连接吸附管的一端、气体流量计和大气采样仪进气口。吸附管装有200 mg的吸附剂。大气采样仪流速设定为500 mL/min。采集时间为2 h。采集完成后立即用浓度为5 ng/μL的苯甲酸甲酯二氯甲烷溶液(苯甲酸甲酯为内标)洗脱吸附管，得到0.5 mL洗脱液置于-20℃冰箱内备用。

1.3 桃树挥发物中EAD活性成分的鉴定

采用Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪对收集的桃树挥发物洗脱液分别进行组分分析。色谱柱为DB-WAX毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，进样量2 μL，无分流进样。柱温升温程序：起始温度40℃，保持1 min，以5℃/min升至180℃，再以10℃/min升至240℃，保持4 min。溶剂延迟5 min。进样口温度230℃，离子源温度250℃，质谱电离方式为EI，电离能量为70 eV，扫描质量范围40～500 amu。

根据质谱数据检索NIST08质谱库鉴定触角电位(EAG)活性成分的结构，并用标准品配制浓度为0.1 μg/μL的正己烷溶液，采用上述升温程序进行保留时间和质谱验证。

1.4 东方绢金龟雌成虫对桃树挥发物的GC-EAD反应

测定所用的设备和技术参考Chen等(2019)。气相色谱柱为DB-WAX毛细管柱(规格同上)，无分流进样。起始温度40℃，保持2 min，以5℃/min升至120℃，再以15℃/min升至240℃，保持4 min。进样口温度230℃，检测器温度为240℃。载气为氮气，流速为2 mL/min。以充满导电液(750 mg/mL NaCl, 35 mg/mL KCl, 29 mg/mL CaCl2·2H2O的水溶液)的毛细管作为电极，快速切下东方绢金龟雌成虫触角，切口端与参比电极相连，触角中间鳃瓣顶端接触记录电极。电极内用银-氯化银丝连接信号探针(EAG Combi Probe, Syntech, Kirchzarten, 德国)，使用GC-EAD软件(GC/EAD32, version 4.4, Syntech)记录和分析数据。

每次取3 μL样品进行试验，至少得到5个成功的GC-EAD结果。若一种物质能引起触角强烈反应且能重复3次以上，则视为电生理活性物质。结合GC-MS结果，从而鉴定出对东方绢金龟雌成虫触角产生电生理反应的物质。

1.5 东方绢金龟雌成虫对EAD活性挥发物标准品的EAG反应

选择由GC-EAD和GC-MS所鉴定出的活性化合物(表1)，用1 mL正己烷作溶剂将各化合物分别配制成浓度为0.1, 1和10 μg/μL的溶液，以正己烷作为对照进行触角电位测定。

测定所用的设备和技术参考李娅娅等(2018)。触角连接方法同上述GC-EAD操作，使用EAG 2000软件(Syntech, Kirchzarten, 德国)记录和分析数据。取10 μL待测样品，均匀地滴在40 mm×5 mm滤纸条上，待溶剂挥发15 s后放入玻璃巴斯德管中，密闭平衡40 s后用于刺激触角连接。吹向触角连接的湿润空气的流速为1 L/min。按随机方式测试样品，每次刺激时间为0.2 s，刺激间隔为2 min。用正己烷对照的EAG值校正样品的EAG值。

1.6 东方绢金龟雌成虫对EAD活性挥发物标准品的行为反应

使用表1中的标准品，用1 mL正己烷作溶剂将各化合物配制成浓度为10 μg/μL的溶液，以正己烷作为对照，测定东方绢金龟成虫对桃树挥发物的行为选择。

Y型嗅觉仪生物测定装置参考李俊龙等(2019)。测试时，用移液枪吸取10 μL挥发物或正己烷滴在1 cm2的定性滤纸上，并置于味源瓶中。通过聚四氟乙烯软管将活性炭空气过滤装置、QC-1B型采样仪、蒸馏水加湿瓶以及Y型管相连，空气流速控制在500 mL/min。每10头东方绢金龟雌成虫为一组，重复5次。每次只放1头东方绢金龟雌成虫进行行为选择，每头试虫观察15 min，将进入选择臂且超过选择臂1/2以上并停留超过30 s的记为有选择，否则记为无选择。每测试一头试虫后将Y型管两支臂互换，并空吹20 min，每5头测试完成后，将整个系统中的玻璃仪器清洗，放入烘箱，温度为180℃，时间为30 min。

1.7 数据分析

触角电位数据均为校正后的EAG反应绝对值，即将样品EAG测量值减去空白对照的EAG测量值。用SPSS 18.0软件进行数据分析，东方绢金龟雌成虫的EAG反应绝对值(平均值±标准误，n=7)采用Tukey-HSD检验，比较分析东方绢金龟雌成虫对不同测试样品的EAG反应的差异显著性；行为试验数据采用卡方检验，比较东方绢金龟雌成虫对不同挥发物行为反应的差异显著性，并通过以下公式计算选择率：

选择率(%)=处理臂内的总虫数或对照臂内的总虫数/做出选择的总虫数×100%。

2 结果

2.1 东方绢金龟雌成虫对桃树挥发物的GC-EAD反应

GC-EAD结果表明，有6种桃树挥发物成分可重复引起东方绢金龟雌成虫的EAD反应(图1)，经GC-MS鉴定分别为反-2-己烯醛、顺-3-乙酸己烯酯、反-3-己烯醇、顺-3-己烯醇、水杨酸甲酯以及1种未知化合物，其相对含量见表2。内标苯甲酸甲酯也能引起东方绢金龟雌成虫明显的EAD反应。

图1 东方绢金龟雌成虫对桃树挥发物的GC-EAD反应

表2 桃树挥发物中EAD活性物质的相对含量

2.2 东方绢金龟雌成虫对5种桃树挥发物成分的EAG反应

东方绢金龟雌成虫触角在不同剂量下对5种桃树挥发物成分及苯甲酸甲酯都有明显的EAG反应。随着剂量增大，EAG反应越强烈。当挥发物成分的剂量分别为1和10 μg时，东方绢金龟雌成虫触角对反-2-己烯醛的反应显著大于对其余4种挥发物成分的反应(1 μg:P<0.0001; 10 μg:P<0.0001)；当挥发物成分的剂量为100 μg时，东方绢金龟雌成虫对反-3-己烯醇和水杨酸甲酯的反应最强烈，EAG反应值均为2.810 mV；对顺-3-己烯乙酸酯的反应最小，EAG反应值约为1.209 mV，显著低于对其余4种挥发物成分的反应(P<0.0001)。

2.3 东方绢金龟雌成虫对5种桃树挥发物成分的行为反应

利用Y型嗅觉仪，分别测试了东方绢金龟雌成虫对5种桃树挥发物成分及苯甲酸甲酯在剂量为100 μg时与正己烷对照之间的选择性(图3)。结果表明，100 μg的反-3-己烯醇、顺-3-己烯醇和苯甲酸甲酯对东方绢金龟雌成虫都表现出显著的吸引作用，其中选择反应率最高的是顺-3-己烯醇和苯甲酸甲酯，均为64%；其余3种桃树挥发物样品对东方绢金龟雌成虫没有表现出显著的吸引或驱避作用。

图2 东方绢金龟雌成虫对不同剂量的桃树挥发物成分及苯甲酸甲酯的EAG反应

图3 东方绢金龟雌成虫对桃树挥发物成分及苯甲酸甲酯(100 μg)的行为反应

3 讨论

本研究鉴定了在东方绢金龟寄主定位中发挥作用的桃树挥发物成分。首先，利用GC-EAD和GC-MS技术鉴定出了6种有EAD活性的桃树挥发物成分，包括醛类、醇类和酯类及1种未知化合物，其中酯类含量最高，约占30%。其次，测试了东方绢金龟雌成虫触角对不同剂量挥发物成分的EAG反应，结果表明随着测试的挥发物成分剂量升高EAG反应值增大。最后，通过行为生测试验发现反-3-己烯醇和顺-3-己烯醇对东方绢金龟雌成虫具有显著的吸引作用。

这几种植物挥发物对其他金龟甲的吸引作用已有报道。例如，顺-3-己烯醇对庭园发丽金龟Phylloperthahorticola有强烈的吸引作用(Rutheretal., 2002)。反-3-己烯醇、顺-3-己烯醇都能在一定程度上引诱五月鳃金龟Melolonthamelolontha(Reineckeetal., 2005)。东方绢金龟与铜绿丽金龟Anomalacorpulenta都对水杨酸甲酯有显著的电生理反应(鞠倩等, 2016)，这可能与它们取食相同的寄主植物有关。孙凡等(2006)研究发现，反-2-己烯醛能引起东北大黑鳃金龟Holotrichiaoblita雌、雄成虫显著的EAG反应，且行为测试显示反-2-己烯醛对该成虫具有吸引作用。但是在复杂的自然环境中，各种挥发物都不是单独存在的，昆虫定位寄主植物不仅依靠单个物质，因此将不同化合物按一定的比例混合，可能会增强它们的引诱力(Ladd and McGovern, 1980; Pauletal., 2009)。本研究鉴定出的活性物质对东方绢金龟的最佳引诱比例还有待进一步研究。

昆虫对具有EAD活性物质的电生理和行为反应与其相对含量不一定呈正相关。玉米果穗挥发物中含量较低的顺-3-己烯醇和含量较高的(+)-环苜蓿烯、β-石竹烯均对未交配亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis成虫有引诱作用(蒋兴川等, 2018)。本研究鉴定的具有EAD活性物质中，顺-3-己烯乙酸酯的相对含量最高，约为28%，但其引起的试虫EAG反应值较小且对东方绢金龟雌成虫无显著的吸引作用；相反，相对含量较低的顺-3-己烯醇和反-3-己烯醇却对东方绢金龟雌成虫有明显的吸引力(表2；图2)，这表明低含量物质可能在其寄主定位中发挥关键的作用。

昆虫对某些刺激物的EAG反应程度与行为反应相一致，但对另外一些刺激物，两种反应则可能表现为不相关甚至负相关(郭线茹等, 2003; 张振等, 2010)。如绿叶气味中的反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇都能引起东北大黑鳃金龟成虫较强的EAG反应，但反-2-己烯醛对成虫具有定向作用，而5-甲基-1-己醇对成虫无显著的行为作用(孙凡等, 2006)。在本研究中，东方绢金龟雌成虫对水杨酸甲酯有较高的EAG反应，但趋向行为反应不显著(图2和3)。这表明EAG反应只是昆虫触角对外界气味刺激的感受，不能代表行为反应。

不同性别的同种昆虫对气味的敏感性存在差异，在寻找寄主、繁殖后代等行为中所采用的策略不同。例如绿盲蝽Lyguslucorum雄虫利用雌虫产生的性信息素搜索、定位雌虫，对性信息素类似物更敏感；而雌虫对植物挥发物更敏感，有利于寻找适宜产卵的寄主(陈展册等, 2010)。华北大黑鳃金龟雌虫对柿树、金银木、榆树挥发物的EAG反应均显著大于雄虫(李娅娅等, 2018)。故本试验选取东方绢金龟雌成虫作为研究对象。综上所述，反-3-己烯醇和顺-3-己烯醇对东方绢金龟雌成虫表现出显著的吸引作用，说明东方绢金龟很可能是利用这几种物质来定位桃树。本研究为开发安全、高效的植物源引诱剂奠定了基础，同时为其他金龟甲的绿色防控提供了技术参考。反-3-己烯醇和顺-3-己烯醇对东方绢金龟的引诱作用，还需进行田间试验进一步验证和筛选。