大麦籽粒抗性淀粉含量快速测定方法研究

魏 霞， 陈功海， 龙周锴， 范小峰，张文英， 徐延浩

(1.长江大学农学院涝渍灾害与湿地农业湖北省重点实验室/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，湖北荆州 434100； 2.荆州市农业科学院，湖北荆州 434025)

抗性淀粉是指不被正常人体小肠所消化吸收的淀粉及其降解物[1]，能降低餐后血糖水平，调节肠道代谢，预防结肠癌，防止脂肪堆积和控制体重等[2-3]。大麦(HordeumvulgareL.)籽粒富含β-葡聚糖、抗性淀粉、γ-氨基丁酸和生育三烯酚等保健成分，是典型的药食同源作物[4]。不同品系大麦籽粒抗性淀粉含量差异显著[5-6]，通过全基因组关联分析[5]、QTL定位[4]等对抗性淀粉进行的遗传研究，为高抗性淀粉基因的精细定位及品种选育奠定了基础。常用谷类抗性淀粉含量测定主要是基于酶解显色法(AOAC，2002)[7]，该方法步骤繁琐、耗时长、成本高。抗性淀粉测定方法是高抗性淀粉大麦遗传研究与品种育种的瓶颈之一，亟待探索一种简单、快速、低成本的抗性淀粉含量测定方法。

衰减全反射中红外光谱(attenuated total reflection mid-infrared spectroscopy,ATR-MIR)和近红外光谱(near-infrared spectroscopy,NIR)检测技术具有快速、准确、低成本、无损等特点，MIR光谱技术在麦芽品质分类[8]、豆粕掺假识别[9]、小麦制品的呕吐毒素污染水平快速测定[10]等方面已有应用。NIR光谱技术在谷物蛋白定量分析[11-12]、淀粉含量测定[13]、种子活力指标的测定[14]及稻谷胶稠度的测定[15]等方面已有应用，并被应用于甘薯[16]、马铃薯[17]和水稻[18]的抗性淀粉含量预测和材料筛选工作。但NIR光谱技术在大麦抗性淀粉含量的光谱测定还未见报道，也未见利用ATR-MIR法进行谷物籽粒抗性淀粉预测的报道。

本研究拟利用ATR-MIR和NIR光谱构建一种简单、快速、低成本的大麦籽粒抗性淀粉含量预测方法，为大麦抗性淀粉育种建立一种快速、高效群体材料筛选方法；同时，比较ATR-MIR和NIR光谱技术对大麦抗性淀粉含量的预测性能，拓宽ATR-MIR光谱方法在谷物化学计量学方面的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以长江大学农学院保存的136个有稃大麦为材料，其中114个组成校正集，22个用于验证模型，材料信息见表1。2017年5月对供试材料进行收获、脱粒、除杂、晾晒，室温保存1个月后，用于后续试验。

1.2 样品制备

每份材料选取饱满、无病害、无霉变、籽粒大小均匀度一致的样品约5 g，经干燥后用配有标准的0.8 mm筛板的旋风粉碎机(Perten Laboratory Mill 3100)打磨成细粉，装入纸袋中，经干燥、平衡保持水分为13.00%，备用。

1.3 籽粒抗性淀粉的化学方法测定

供试大麦籽粒抗性淀粉含量化学测定参照AOAC 2002.02方法[7]，用Megazyme抗性淀粉试剂盒(Ireland. K-RSTAR)进行测定。抗性淀粉含量(%)=[样品吸光值/D-葡萄糖(1.0 mg·mL-1)标准液的吸光值]×(92.7/0.87)。每个样品3次重复。

1.4 光谱采集

1.4.1 衰减全反射中红外光谱的采集

采用美国赛默飞世尔科技公司带有衰减全反射(attenuated total reflection,ATR)附件的Nicolet is5红外光谱仪对校正集样品进行MIR光谱测定。光谱采集范围设定为525～4 000 cm-1、分辨率为4 cm-1、扫描时间16 s。以空气为采集背景，每个样品测定后用无水乙醇擦拭探头和检测窗口，自然晾干后进行下一个大麦籽粒样品光谱的采集，每个样品重复3次。

1.4.2 近红外光谱的采集

采用瑞典波通仪器公司生产的DA7200近红外仪对校正集样品进行NIR光谱采集，光谱范围设置为950 nm～1 650 nm，分辨率设置为2 nm，扫描32次。测定时使样品盒中的样品保持平整。每个样品3次重复。

1.5 样本数据的划分

将所有样品的ATR-MIR和NIR光谱数据分别与抗性淀粉含量的化学方法实测值对应整合后随机分为校正集和验证集，在Unscrambler 9.7(美国CAMO公司)软件中使用强影响点模型对校正集数据进行异常值去除，将剩余的校正集样品用于模型的建立，而验证集样品用于模型的验证。

1.6 光谱预处理

为了减少随机噪音、光散射及基线漂移等对光谱的影响，在建立预测模型之前，运用平滑(消除噪音)、多元散射校正(消除颗粒不均匀产生的散射对光谱的影响)、导数(消除基线平移或漂移)等方法预处理光谱，以提高模型的稳定性。

1.6.1 衰减全反射中红外光谱预处理

对ATR-MIR光谱的校正集数据进行三种不同的预处理：高斯滤波平滑(gaussian filter smoothing，GFS)+基线位移校正(baseline offset correction，BOC；以下简称GFS+BOC)；多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)+savitzky-golay法一阶求导(平滑点数15；以下简称MSC+1thD)；基线位移校正(baseline offset correction，BOC)+范围归一化(range normalization，RN；以下简称BOC+RN)。

1.6.2 近红外光谱预处理

对NIR光谱的校正集数据进行三种不同的预处理：面积归一化(area normalization，AN；简称AN)；基线位移校正(baseline offset correction，BOC)+S-G卷积平滑法(saviteky golay smoothing，SGS；简称BOC+SGS)；标准正态变换(standard normal variate，SNV)+savitzky-golay法一阶求导(平滑点数21；简称SNV+1thD)。

1.7 预测模型的评价与验证

用外部验证集数据检验其预测值和实测值之间的符合程度，预测值数据和实测值数据之间的决定系数越大，平均相对误差值越小，说明两者间的符合程度越好，并通过方差分析检验两者间的差异性。最大主成分(principal components,PCs)设为20，通过残余方差分析(residual validation variance)确定模型的最佳主成分数。

2 结果与分析

2.1 校正集和验证集品种籽粒抗性淀粉含量统计分析

使用强影响点模型分别对ATR-MIR(图1A)和NIR(图1B)校正集进行异常值分析，去除2个异常样品(CSK-81-556和Adagio)，校正集剩余样品数量为112个。校正集材料籽粒抗性淀粉含量最低为0.925%±0.023%(Zita，Weeah,TR06106)，最高为 6.315%±0.231%(WA13590)，平均含量为2.073%，变异系数为58.177%(表1)。验证集22个材料籽粒抗性淀粉含量最低为0.945± 0.050%(WA13240)，最高为6.125± 0.214%(WA86372)，平均含量为2.455%，变异系数为58.411%。由此可见，参试大麦材料抗性淀粉含量差异较大，校正集和验证集的分布在合理范围，样本数量已经超过ATR-MIR和NIR基础模型的要求。

A:衰减全反射中红外光谱校正模型；B:近红外光谱校正模型。

表1 供试大麦材料来源及籽粒抗性淀粉含量统计

(续表1 Continued table 1)

2.2 衰减全反射中红外光谱最佳预测模型的筛选

A:光谱范围在525～2 954 cm-1之间的ATR-MIR光谱；B:光谱范围在950～1 650 nm之间的NIR光谱。

表2 大麦籽粒抗性淀粉衰减全反射中红外和近红外光谱最佳预测模型的筛选

2.3 近红外光谱最佳预测模型的筛选

2.4 最佳预测模型的检验

用验证集样品进行ATR-MIR和NIR光谱最佳预测模型的验证。使用BOC+RN预处理的ATR-MIR预测模型的相对误差范围为1.532%～23.941%，平均相对误差为10.072 %；使用SNV+1thD预处理的NIR预测模型的相对误差范围为8.133%～29.913%，平均相对误差为 17.400%(表3)。BOC+RN预处理的ATR-MIR预测模型验证集样品的预测值和实测值之间的决定系数(R2)为0.941 0(图3A)，SNV+1thD预处理的NIR预测模型验证集样品的预测值和实测值之间的决定系数为0.842 9(图3B)，这两种最佳预处理的预测值与实测值之间没有显著性差异(Turkey 法多重比较)，而BOC+RN预处理的决定系数(R2)比SNV+1thD预处理的决定系数高，相对误差平均值较SNV+1thD预处理的低。这与表2中的ATR-MIR光谱所建模型的所有决定系数都高于NIR光谱模型的决定系数，误差值低于NIR光谱的误差值结果一致，由此可见，ATR-MIR和NIR光谱技术都可以应用于大麦籽粒抗性淀粉含量预测，ATR-MIR光谱技术具有更高的预测准确性和精确度。

表3 大麦籽粒抗性淀粉衰减全反射中红外和近红外光谱最佳预测模型的验证

A:BOC+RN预处理的ATR-MIR光谱;B:SNV+1thD预处理的NIR光谱。

3 讨论与结论

抗性淀粉作为一种新型膳食纤维，具有改善人类健康的巨大潜力[1-3,20]。近年来，高抗性淀粉谷物的遗传和育种研究受到广泛关注[21]。已有的研究表明，通过遗传选择提高大麦籽粒抗性淀粉含量是可行的[4-5]。遗传选择的一个重要前提是能高效筛选大量群体材料，获得优异株系。但现有谷物抗性淀粉测定方法繁琐、耗时、成本高，研究简单、快速、准确的抗性淀粉测定方法，对于加速谷物高抗性淀粉育种具有重要意义[20]。

本研究基于ATR-MIR和NIR光谱技术，结合BOC、SGS、MSC、SNV等光谱预处理方式，采用PLS建立大麦籽粒抗性淀粉预测模型，通过对不同预处理的结果进行比较分析，筛选出最佳ATR-MIR和NIR预测大麦籽粒抗性淀粉含量的模型，分别对这两种最佳预测模型进行验证，结果显示预测值和真实值间没有显著性差异，表明ATR-MIR和NIR光谱模型均可代替化学测定法实现对大麦籽粒抗性淀粉含量的预测。与化学定量法相比，光谱方法对样品进行测定和分析的总时间少于5 min，极大的提高了测定效率，为大麦抗性淀粉研究和利用提供了新方法。但值得注意的是，ATR-MIR 和NIR光谱技术主要借助光谱反射进行测定，本研究使用的材料全部为有稃大麦，该模型是否适用于裸粒大麦还需要更多的验证。

Ferreira等[22]使用这两种光谱技术预测大豆样品中的物质含量，结果建议使用NIR光谱技术预测蛋白质和脂质的含量，使用MIR光谱技术预测灰分和水分的含量。Sisouane等[23]认为MIR比NIR光谱技术能更好的预测有机废物和堆肥中有机碳和总氮含量。但Zhang等[24]的研究结果表明，在预测牛奶中的脂肪和蛋白质含量上这两种光谱技术没有差异。本研究的结果表明，在预测大麦籽粒抗性淀粉上，与NIR光谱相比，ATR-MIR光谱的R2相对较高，RMSE相对较小，具有更好的预测性能。MIR光谱识别的是分子基团的基本振动吸收，而NIR光谱识别的是分子基团的合频及倍频振动，这可能是这两种光谱定量分析具有不同的预测效果的原因之一。