交联透明质酸钠凝胶研究进展

苏江伟，张 燕，吴万福，李 漫，杨莹莹，刘建建，穆淑娥，郭学平

(华熙生物科技股份有限公司，山东 济南 250101)

1 引言

水凝胶有许多独特的特性可以应用于组织工程领域，如与组织胞外基质相似性、可以支持细胞的增殖和迁移、控制药物和生长因子的释放，对周围组织的机械破坏小[1]。透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种天然粘多糖，因其分子量巨大，表现出独特的粘弹性、优越的生物学形容性和可解性，被视作理想的组织工程材料。由于天然HA水凝胶稳定性差、对透明质酸酶和自由基敏感、在体内保持时间短、机械强度差，但通过对其进行化学修饰和交联，增强了凝胶力学强度、稳定性和抗降解性能，使其在体内可以维持更长时间，进而获得了一系列新型的具有生物活性和功能性的HA凝胶，扩大了其在生物医药和组织工程领域的应用。除了在传统的眼科手术和关节疾病、术后防粘连、软组织填充领域的应用，近年来HA凝胶因其特有的粘弹性逐渐应用于药物和蛋白载体系统、细胞培养支架、术后创伤愈合等领域[2]。

2 HA的化学修饰和交联位点

通过多样的化学修饰和交联反应可以改变HA凝胶的物理和化学性能达到预期目的。不同的修饰位点和方式可以得到性能多样的凝胶。与天然HA凝胶相比，交联凝胶衍生物在物理和化学性能有明显的提升，但其生物相容性和生物可降解依然没变。正是基于这一点，对HA进行修饰的研究越来越深入，HA链上可以被修饰的位点有：羟基、羧基和乙酰氨基[3]，其中羟基和羧基的修饰为当下热点(图1)。

羟基的修饰主要有四种形式：醚键、酯键、半缩醛反应、氧化反应[2]。传统的交联剂有：1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、二乙烯基砜(DVS)、戊二醛(GTA)等都可以与HA的羟基反应。BDDE作为制备HA凝胶最常用的交联剂，在碱性条件下环氧基团开环与HA羟基反生反应形成醚键[4]，此法制备HA凝胶多用于美容填充领域，并且已有许多产品上市，如Restylane、Juvederm、润百颜等，是交联HA凝胶应用最活跃的领域；DVS作为交联剂可以在室温下进行交联反应形成醚键，制备的凝胶大大提高了其在碱性条件下的抗降解能力[5]；GTA在酸性条件下与羟基反应生成醚键，但酸性条件下的交联反应并不稳定并且凝胶容易水解[6]；辛烯基琥珀酸酐(OSA)在碱性条件下与HA的羟基反应形成酯键[7]；甲基丙烯酸甲酯在碱性条件下通过酯化反应修饰HA，甲基丙烯酸甲酯接枝到HA主链上可进行下一步的光交联[8]；高碘酸钠通过氧化HA的羟基打开六元环形成二醛，这种醛基化的HA可以作为席夫碱反应的前体，可进行下一步交联反应[9]。

图1 透明质酸钠的主要修饰位点

羧基端的修饰反应主要是羧基和氨基基团反应形成酰胺键。整个反应一般有两个过程：首先是羧基基团的活化，活化剂与羧基基团生成一种加成物，随后氨基基团作为亲核基团攻击活化加成物形成不含活化剂的交联键。如己二酸二酰肼(ADH)与经碳二亚胺(EDC)活化的HA羧基基团反生形成酰胺键制备交联HA凝胶[3]；呋喃甲胺经N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化后与羧基形成酰胺键修饰HA[10]。

3 交联透明质酸凝胶的制备

设计一款用于组织工程和生物医药领域的凝胶需要考虑到多方因素，如生物相容性、抗降解性能、机械性能(硬度)、孔隙率(物质渗透和气体交换)和持水性能等。基于这些因素的需求，越来越多的交联方式被开发应用，如席夫碱反应、硫醇修饰HA、狄尔斯-阿德尔反应、叠氮化物-炔反应、酶催化交联HA、温敏型凝胶、光交联等，其中席夫碱反应、硫醇修饰HA、狄尔斯-阿德尔反应、叠氮化物-炔反应都属于点击化学范畴。

3.1 席夫碱(Schiff-base)反应交联凝胶

得益于温和的反应条件和较快的反应速度，HA通过席夫碱反应制备凝胶的方式逐渐被关注[11]。席夫碱反应一般的反应方式是酮基或醛基与胺发生缩合反应，其反应温和且制备的凝胶可以作为蛋白药物载体和细胞支架。

Huaping Tan等[12]通过EDC和HOBt活化后与乙二胺偶联得到氨基修饰的HA(HA-NH2)，并且用高碘酸钠氧化乙二醇与HA反应得到醛基修饰的HA(HA-CHO)。HA-NH2和HA-CHO在室温下发生席夫碱反应进行初步交联形成凝胶(如图2)，京尼平与HA-NH2的氨基反应进行二次交联。经两次交联后的凝胶生物相容性良好，内部网络更致密，抗压能力更强，持水能力没有改变，其抗降解能力突出，在透明质酸酶的作用下，可以维持4周，该凝胶可以作为注射类支架用于组织工程。Elena Martínez-Sanz等[13]制备了一种载药凝胶用于骨增长。HA的羧基经EDC、HOBt活化后将3-氨基-1,2-丁二醇接枝于HA羧基端，形成的衍生物又经高碘酸钠氧化形成HA醛基衍生物。该衍生物又与酰肼化的HA在PBS中发生席夫碱反应30 s内交联形成凝胶，成胶速度非常迅速。同时该凝胶在PBS中浸泡24 h后仍有260 Pa的弹性模量，说明在水中不易分解和分散，这类凝胶作为药物载体可以延长药物半衰期。同样HA也可与一些多糖类反应形成凝胶。Takuro Hozumi等[14]将碳酰肼修饰的明胶与醛基修饰的HA通过席夫碱反应制备凝胶，比较了碳酰肼修饰的明胶与单醛基修饰的HA(Gel-CDH/HA-mCHO)、明胶与双醛基修饰的HA(gelatin/HA-dCHO)、己二酸二酰肼修饰的明胶与双醛基修饰的HA(Gel-ADH/HA-mCHO)、碳酰肼修饰的明胶与双醛基修饰的HA(Gel-ADH/HA-dCHO)抗降解性能，发现Gel-CDH/HA-mCHO抗降解性能远远超出其他凝胶，而并非交联度最大的Gel-ADH/HA-dCHO，可能是由于双醛基是六元环氧开环形成的，酸性条件下更容易发生半缩醛水解，生理条件下也容易发生β消除进而导致糖链断裂。该凝胶中有15-50 μm的小孔可以有效提高细胞的增殖效率，增强细胞的适应性，适合作为细胞支架诱导细胞生长。

席夫碱系统可以完全避免额外有毒交联剂和引起组织不良反应的触发剂的加入。虽然该系统的易用性可以有效转到临床产品中但其凝胶的pH敏感性限制了它的应用[15]。席夫碱反应形成的亚胺基团在酸性条件下容易被水解，所以不能被应用于对凝胶稳定性要求较高的产品中[16]。

图2 Huaping Tan等运用席夫碱反应制备交联凝胶

Fig.2 Synthesis of crosslinking HA-gels vis Schiff base reaction by Huaping Tan

3.2 硫醇修饰的HA凝胶

在氧化状态下，一些硫醇化的聚合物在聚合物链间常常形成二硫键发生自交联，这个特性可以用来制备交联HA凝胶。这类反应之所以备受关注不仅是因为反应温和、便利，还在于凝胶的双降解性，即凝胶可被透明质酸酶和还原性物质降解如谷胱甘肽、半胱氨酸等[17]。Shaoquan Bian等[18]将半胱胺盐酸盐接枝到HA羧基端(如图3)，得到的HA衍生物溶于水后与空气中的氧反应1 h，即得自交联的HA凝胶。这类反应不引入其他化学物质交联剂和副产物，并且凝胶化时间、溶胀度、机械性能都可控，可以作为细胞培养的支架。凝胶的降解过程中还原型谷胱甘肽的加入可以加速凝胶的去凝胶化，当该凝胶作为细胞支架时，可以通过控制谷胱甘肽的加入进而加快去凝胶化，有效控制了细胞的释放速度。Thomas I等[19]将经硫醇基团修饰后的HA与氧化型谷胱甘肽通过硫醇-二硫化物交换反应，4 mM的GSSG与0.4%的硫醇修饰的HA在5 min内就可以反应形成凝胶。利用硫醇-二硫化物交换反应可以将蛋白中半胱氨酸的硫醇键与HA上的硫醇键共价交联，使一些与硫醇相容的多肽或蛋白可以连接到HA链上，这就为药物蛋白的缓释载体研究提供了新方向。

虽然这个过程反应条件温和、反应速度快，但在有还原性物质存在下凝胶中的二硫键容易被打断反生去凝胶化，影响了其在对凝胶抗降解性能要求高的领域应用[20]。

图3 半胱氨酸接枝到透明质酸羧基端

Fig.3 Grafting the cysteine to the carboxyl of HA

迈克尔加成反应的是碱性条件下硫醇类与不饱和羰基的亲核加成反应，α,β不饱和酯类、乙烯基砜、马来亚酰胺常被连接到HA骨架上与硫醇发生交联反应。Chixuan Liu等[21]通过胱胺二盐酸盐的介导将表焙儿茶素-3-O-没食子酸(EGCG)接枝到HA主链上。首先他们活化HA后将胱胺二盐酸盐接枝到HA链上，经三(2-羧乙基)膦打断二硫键后，EGCG上的醌基与硫醇基在30 °C、pH 7.4的环境下发生迈克尔加成反应并连接到HA链上。得到的HA凝胶(HA-EGCG)具有清除自由基的作用，并且可以抑制透明质酸酶的酶活。为了进一步反应增强凝胶的抗酶解性能，通过辣根过氧化物酶催化的氧化偶联反应，得到交联HA-EGCG凝胶抗酶降解性能进一步增强。降解实验显示体外降解凝胶维持了20天、老鼠体内实验维持了56天，并且组织学和血液学分析表明该注射该凝胶引起的炎症反应很小。温和的反应条件、优越的抗降解性能和较小的不良反应使该凝胶在组织工程领域有广阔的应用前景，尤其作为注射凝胶用于医疗美容行业。

3.3 狄尔斯-阿德尔反应(Diels-Alder)反应交联凝胶

狄尔斯-阿德尔反应是共轭二烯与取代烯烃的共价耦合反生的[4+2]环加成反应，反应高效、条件温和并且不需要催化剂。虽然反应条件温和、容易控制凝胶的机械性能但凝胶的成胶时间长影响着该方式的应用。Feng Yu等[22]通过酶催化交联和DA反应两步交联制备了一种用于软组织工程的凝胶。他们将呋喃甲胺和酪胺共同接枝到HA链上，同时加入二马来亚胺，在辣根过氧化物酶和DA反应的共同作用下，形成HA双交联结构的凝胶。该方法解决了酶催化交联的凝胶机械性能差、DA反应交联的凝胶成胶时间长的问题。其中，酶催化反应在5 min内完成，凝胶存储模量和压缩形变分别达到了27 kPa和81.9%，反应迅速、良好的机械性能和形变恢复能力使该凝胶在作为细胞传递系统用于软骨组织工程具有明显优势。Dongming Xing等[23]将甲基丙烯酸酯和呋喃甲胺接枝到HA链上，通过硫醇-烯烃反应(属于迈克尔加成反应)将一种层粘连蛋白源多肽CQAASIKVAV联结到HA链上(如图4)；再通过二马来亚酰胺PEG与呋喃基团反生DA反应形成交联凝胶，从而制备了一种药物蛋白凝胶。该凝胶可以控制甲基丙烯酸、呋喃甲胺的修饰度来控制蛋白含量和凝胶的机械性能，进而控制蛋白释放速率，为HA凝胶在细胞培养支架和载药方面提供一种新模式。

图4 Dongming Xing等运用狄尔斯-阿尔德反应制备交联HA凝胶

Fig.4 Synthesis of crosslinking HA-gels vis Diels-Alder reaction by Dongming Xing

3.4 叠氮化物-炔反应交联凝胶

铜催化的叠氮化物-炔1,3-偶极环加成反应，形成1,2,3-三唑环。该反应的易用性表现在其高回收率、副产物低毒性、反应在生理条件下即可完成，并且该反应的催化剂可以是细胞中氧化反应产生的Cu(I)离子。Akira Takahashi等[24]利用环辛炔分子内环张力可以促进[3+2]环加成反应而不需要催化剂的特性，与叠氮化物反应制备HA凝胶(图5)。作者通过一系列的化学反应设计分别得到了得氮化物修饰的HA(HA-A)和环辛炔修饰的HA(HA-C)。HA-A和HA-C溶液用双管的注射器混合后注射到体内，交联反应在生理条件无催化剂作用下即可完成，成胶时间主要取决于交联HA的浓度，5%浓度的HA在5 min内即可成胶。该凝胶体外的PBS中可以维持2周，在透明质酸酶存在的情况下可以维持9天，在牛血清存在的细胞培养基中可以维持4天，并且细胞相容性实验表明HA-C和HA-A具有良好的生物相容性而且其毒性与HA相同，因此该凝胶可以应用于细胞支架和细胞支持配体等领域。Shuangli Fu等[25]利用叠氮化物-环辛炔反应制备了一种HA/PEG共聚物凝胶，在生理条件下环辛炔修饰的HA与叠氮化物修饰的PEG反应迅速，只需要改变两者的比例就能得到不同性质的凝胶。叠氮化物与环辛炔反应形成的化学键较为稳定，这就使制备的凝胶有更好的机械性能和抗降解能力，从而在外科手术填充材料领域有广阔的应用。

图5 叠氮化物与环辛炔反应

3.5 酶催化交联的HA凝胶

酶交联反应是一种酶催化的氧化反应，是一种非常常用的凝胶制备方式。这类反应过程是在生理条件下完成，这更符合组织工程凝胶的要求；其次该反应具有高度的生物相容性。一些由蛋白、胶原和明胶与HA组成的复合凝胶可以通过酶反应制备交联凝胶。如谷氨酰胺转移酶能够介导氨基和羧基反应形成酰胺键，可以用于复合凝胶的制备。但是酶交联制备的HA凝胶的一般机械性能较差，并且抗降解性能不佳，可能跟酶促反应本身有关[11]。为改变这一状况，Nicole R.Raia等[26]用丝素蛋白与酪胺化的HA通过辣根氧化酶催化两个酪胺基团反应形成复合交联凝胶，通过交联反应该凝胶被赋予了丝素蛋白的机械性能和HA的生物学性能。该系统在20 min内即可反应形成凝胶，并且其存储模量高，表现出优秀的机械整体性和抗酶解性能，并且通过改变HA含量可以控制成胶时间、降解速率和凝胶粘弹性。硫醇化的HA凝胶在体内2周之内就降解完全，酪胺交联的HA可以维持1个月，丝素蛋白HA复合凝胶15周后仍能保持形状。丝素蛋白和HA的不同配比会导致不同的降解时间，降解时间的可控可以使该凝胶有不同领域的应用，如组织再生领域、药物传递系统等。

3.6 温敏型HA凝胶

由于在一定温度下一些聚合物会改变溶解状态和发生相位转变，由溶液状态会转化成凝胶态。这一特性被用来制备的水凝胶在室温条件下呈现出液体状态发，在生理温度下转变为凝胶态。例如，Huaping Tan等[27]将聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)接枝到HA上制备出一种共聚物凝胶，在30 ℃下，从液态转换成凝胶态只需要1 min。并且这种凝胶的抗酶解性能强，体外降解实验显示在透明质酸酶的存在下该凝胶可以维持28天。这种特性适用于将细胞封装到凝胶中并作为细胞支架。Gert-Jan A.ter Boo等[28]介绍了一种用于外科手术的温敏型载药凝胶，将聚N-异丙基丙烯酰胺接枝到HA链上，形成一种共聚物凝胶。在25 ℃下呈现出溶胶状态，可以将庆大霉素分散均匀，与组织接触后迅速变成凝胶状。因为常温下处于溶胶状态，能够在手术伤口部位分散均匀，解决了普通抗生素载药材料空间分布不均匀的问题，并且可以应对各种复杂伤口的要求，有效防止了伤口感染。

3.7 光交联凝胶

光交联的主要原理是在可见光或紫外的照射下，光引发剂产生自由基进而引起的聚合物交联反应。通过这类反应可以制备植入型凝胶，凝胶前体和引发剂植入到缺陷部位，然后强光透皮照射形成交联凝胶。常见的交联反应主要是将丙烯酸类基团、酰胺基团、硫醇-烯基团通过光引发形成共价交联制备交联凝胶。

图6 Patrick E. Donnelly等运用光交联

Liming Bian等[29]利用光交联技术制备了一种稳定的3D HA凝胶作为干细胞支架用于软组织再生。他们将甲基丙烯酸酐接枝到HA链上，并以2-甲基-1-[4-羟乙基苯基]-2-甲基-1-丙酮作为光引发剂制备交联凝胶。作为干细胞支架，凝胶的交联度不仅影响凝胶的机械性能和大分子扩散性，还影响软骨基质含量、基质的分散和基质的钙化等。低交联度的凝胶能更好的实现软骨基质的空间均匀分布，通过改变HA含量和光照时间控制凝胶在合适的交联度，在5%的HA含量和5 min的紫外照射下迅速形成凝胶，并且成功诱导骨髓间充质干细胞的增生和分化。Patrick E.Donnelly等[30]介绍了一种可调节机械性能的光交联凝胶用于关节软骨组织修复。作者设计用酪胺修饰HA的羧基基团，得到的HA衍生物(HA-TA)用核黄素作为光引发剂经紫外照射后得到酪胺自交联的凝胶(图6)。通过改变核黄素和HA-TA的浓度、紫外照射时间控制凝胶的机械性能。经紫外照射后凝胶的最短成胶时间为2.5 min，凝胶的存储模量可以从5 Pa达到16 kPa，相比于酶催化的HA-TA，核黄素光交联系统制备的凝胶机械性能更强。在核黄素光交联系统中酪胺可以与芳香族氨基酸反应，通过这个原理作者设计了将HA-TA与关节软骨进行光交联反应，从而使凝胶与软骨表面联结。这可以应用于关节软骨缺陷的修复、软骨移植时增强软骨组织和宿主组织之间缝隙的联结。

虽然光交联反应制备凝胶反应迅速且高效，但长时间的紫外照射会对细胞、蛋白和DNA造成不可逆的破坏，对其在组织工程领域的应用有了诸多限制。

4 展望

本综述着重介绍了一系列通过化学修饰和交联制备基于透明质酸的水凝胶。交联后的HA凝胶在机械性能、生物可降解性和细胞相容性等方面明显提升，对其在细胞支架、生物活性分子的载体和创伤愈合等方面的应用提供了保障。随着技术革新交联方式由传统的交联方法(BDDE等)逐渐向简单化、可控化、智能化的交联方式转变。应用领域的不断扩大，HA交联凝胶越来越受到关注，也将得到更广泛的应用。