10种中药材和大蒜提取液对菊果胶杆菌的抑菌效果

周 勇， 代小莹， 刘 昔， 龚明福， 刘 忠， 曾建威

(1.乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614000； 2.峨眉山生物多样性保护与利用研究所，四川乐山 614000；3.眉山职业技术学院，四川眉山 620010； 4.四川省乐山市经济作物站，四川乐山 614000)

菊果胶杆菌(Pectobacteriumchrysanthemi)属软腐果胶杆菌属(Pectobacterium)，是魔芋软腐病主要致病菌之一[1]。与菊欧文氏菌(Dickeyadadantii)和菊欧文氏杆菌(Erwiniachrysanthemi)相比，菊果胶杆菌对魔芋软腐病的致病性更强[2]。目前，魔芋软腐病主要采用化学方法进行防治，钟艳红等研究了农用杀菌剂对魔芋软腐病的防治效果，发现用农用链霉素、噻菌铜、叶枯唑、噻唑锌等杀菌剂对种芋进行处理或在发病初期喷施对防治魔芋软腐病有显著效果，其中农用链霉素防治法被普遍认为是魔芋软腐病防治的主要方法[3-7]。生防菌对魔芋软腐病致病菌也具有显著的抑制作用，如枯草芽孢杆菌的30%硫酸铵盐析蛋白对胡萝卜软腐欧文氏杆菌具有较强的抗菌活性[8]；密旋链霉菌与肉质链霉菌及其制剂对菊果胶杆菌、菊欧文氏菌和菊欧文氏杆菌具有明显的抑菌效果，在混合接种情况下相对防效最高可达100%[9]。研究发现，中药材提取液对某些植物病害致病菌也具有抑菌作用，如乌梅-五倍子混合液对蝴蝶兰软腐病病原菌有显著的抗菌作用[10]，白花蛇舌草、金钱草、丹参和甘草配伍对细菌和霉菌抑菌效果最好[11]，五倍子对芒果炭疽菌和蒂腐菌抑菌活性最高[12]，大蒜的乙酸乙酯提取物对番茄早疫菌具有较好的抑菌活性[13]，但未见利用中药材对魔芋软腐病致病菌进行抑菌研究的报道。本试验选取10种具有抗菌杀毒作用的中药材和大蒜，制备提取液对魔芋软腐病主要致病菌菊果胶杆菌进行抑菌效果研究，旨在探讨中药材对魔芋软腐病的抑菌效果及机制，探索魔芋软腐病的生物防治新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株为由乐山师范学院微生物研究室分离鉴定的魔芋软腐病致病菌菊果胶杆菌(P.chrysanthemi)。

供试药材为黄连、黄芩、乌梅、百部、五倍子等10种中药材及大蒜(表1)。

表1 供试药材特性与来源

1.2 试验方法

1.2.1 中药材及大蒜提取液的制备

取经粉碎的中药材10 g，加80%乙醇50 mL，35 ℃、150 r/min 恒温振荡提取48 h后，室温下 4 000 r/min 离心 6 min，提取母液，并编号，5 ℃暗处储存备用。鲜蒜在室温粉碎后，放入28 ℃培养箱酶解30～60 min，然后加入乙酸乙酯在28 ℃、130 r/min 振荡提取12 h，提取母液，标记后于5 ℃暗处储存备用。

提取效率(mL/g)=提取母液量/称取中药材的量。

1.2.2 病原菌菌悬液的制备 将活化的菊果胶杆菌斜面在牛肉膏蛋白胨培养基上30 ℃培养18 h，用无菌水将菌苔洗下，稀释为浓度107～108CFU/mL的菌悬液，备用。

1.3 提取液抑菌效果测验

1.3.1 母液抑菌效果测定 吸取制备的0.1 mL菌悬液加入牛肉膏蛋白胨琼脂平板(直径9 cm)中央，均匀涂布，室温下干燥5 min，取直径1 cm的无菌滤纸片，分别浸入6 mL药液中40 min后，移入已涂布病菌的平板中，每个平板均匀放置4张滤纸片，30 ℃ 培养24 h，用直尺测定抑菌圈直径(包含滤纸片直径)，计算每个平板的抑菌圈平均直径，以抑菌圈的大小表示抑菌能力的强弱，并用80%乙醇摇床24 h处理作为空白对照(CK)，每个处理重复3次。

1.3.2 不同浓度提取液抑菌效果测定 选取“1.3.1”节中抑菌效果最好的3种提取液，按二倍稀释法进行稀释，稀释成5个梯度，按“1.3.1”节的方法进行抑菌效果测试。

1.4 数据处理

数据资料整理在Excel 2010软件中进行，数据统计分析在DPS 7.05统计分析软件中进行，多重比较采用Duncan’s新复极差法(SSR法)。

2 结果与分析

2.1 提取液抑菌效果

由表2、图1可知，在供试的10种中药材和大蒜提取液中，有6种中药材对菊果胶杆菌具有明显的抑菌作用，不同的中药材提取液对菊果胶杆菌抑菌效果差异较大。其中黄连、大蒜提取液抑菌效果最好，平均抑菌圈直径分别为2.27、2.19 cm，极显著优于其他药材及对照；黄芩提取液抑菌效果次之，平均抑菌圈直径为1.68 cm，显著优于百部、金银花，极显著优于对照，乌梅、柴胡也极显著优于对照；白芷平均抑菌圈直径与对照存在显著差异，具有一定的抑菌效果；而百部、金银花、板蓝根、金樱子、五倍子对菊果胶杆菌无明显抑制作用。从提取效率看，抑菌效果较好的黄连、大蒜和黄岑具有较高的提取效率，1 g可以提取2.23～3.40 mL，经济性较好。

2.2 提取液稀释后抑菌效果

选取对菊果胶杆菌抑菌效果较好的黄连、黄芩和大蒜提取液分别按二倍稀释法稀释成5个梯度浓度进行抑菌效果测定，结果(表3)表明，抑菌效果在不同稀释倍数间、 不同药材间差异均较大。稀释后的提取液抑菌效果均显著或极显著下降，黄连和大蒜提取液稀释后抑菌效果极显著下降，黄芩在稀释2～8倍时，抑菌效果显著下降，稀释16倍及以上时抑菌效果极显著下降。

表2 10种中药材和大蒜提取液对菊果胶杆菌的抑菌效果比较

注：同列数据后不同小写字母、大写字母分别表示在0.05、0.01水平差异显著。下表同。

由表4可知，稀释后黄连2倍稀释液抑菌效果最好，极显著优于其他药材稀释液，其平均抑菌圈直径为1.83 cm；黄芩2倍、4倍稀释液和黄连4倍稀释液仍然具有明显的抑菌作用，抑菌效果显著优于对照；当黄连、黄芩稀释倍数达到8倍及以上时，抑菌效果与对照无显著差异。抑菌效果由大到小依次为黄连2倍稀释液>黄芩2倍稀释液>黄芩4倍稀释液>黄连4倍稀释液。大蒜提取液母液抑菌效果较好，且优于除黄连母液外的其他中药材，但是一旦稀释后使用，基本丧失对菊果胶杆菌的抑菌作用。

表3 不同稀释倍数对3种中药材提取液抑菌效果的影响

3 讨论与结论

细菌性病害是植物病害中较为顽固的一类病害，其防治一直是生产上的难点，寻找有效防治药物是细菌性病害防治的关键措施[14]。魔芋软腐病是由菊果胶杆菌、菊欧文氏菌、菊欧文氏杆菌等感染的一类细菌性病害，对魔芋生产构成了极大威胁[2]。目前，生产上对魔芋软腐病的防治常采用链霉素等抗生素和噻菌铜等化学农药，抗生素的长期使用必然会造成细菌耐药性的产生，化学农药的大量使用不仅使病菌逐渐产生抗药性，还会增加环境中的农药残留[15]。因此，开发环境友好、防效显著的防治药物是目前魔芋软腐病防治的研究热点。中药材作为天然的抑菌药物，其抗菌、低毒、无副作用、不会产生残留等特点和优势，在现代预防和控制细菌感染方面发挥了积极作用。由于中药的特殊性，细菌较少对中药产生耐药性[11]。现有研究表明，中药材对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌、芒果炭疽菌和蒂腐菌、蝴蝶兰软腐病病原菌具有较好的抑菌作用[10-12，16]。黄连小檗碱、黄连碱及药根碱已被证实对白色念珠菌[17]、放线菌门和厚壁菌门细菌[18]、大肠杆菌[19]具有较强的抑菌作用；黄芩有效成分对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等均有抑菌活性[20]。本研究发现，中药材黄连、黄芩的醇提取液对菊果胶杆菌具有极显著的抑菌作用，且具有较高的提取效率(2.23～2.87 mL/g)，可作为制备防治魔芋软腐病的生物农药的材料，为魔芋软腐病防治提供一条新的途径，为中药材的进一步开发利用提供参考。

表4 3种中药材提取液在不同的稀释倍数下抑菌效果比较