不同产地鱼腥草中4种活性成分分析评价

焦金英， 姬星宇， 李自波， 李国辉， 王彦辉， 余祖功

(1.商丘美兰生物工程有限公司，河南商丘 476000； 2.南京农业大学，江苏南京 210095； 3.河南普华基因科技有限公司，河南郑州 450000)

鱼腥草为三白草科植物蕺菜(HouttuyniacordataThunb.)的新鲜全草或干燥地上部分，始载于《名医别录》，其后历代本草文献都有记载“以清解肺热见长，为治肺壅之要药”[1-3]。鱼腥草味辛能行散，微寒，归肺经，有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效，用于肺痈吐脓、痰热喘咳、热痢、热淋、臃肿疮毒等病症[4]，自古以来就被视为常用中药之一，尤其对治疗肺痈有特殊疗效。《本草经疏》等古籍一向认为鱼腥草是“治痰热壅肺，发为肺痈吐脓血之要药。”《本草纲目》中认为：鱼腥草能散热毒痈肿[5-8]。现代药理学上鱼腥草有抗菌、抗病毒、增强免疫、抗炎镇痛、利尿止血、通过调节细胞周期和诱导凋亡而抗肿瘤等作用[9-10]。

鱼腥草中含有黄酮类、甾醇类等多种化合物，而挥发油为其主要有效成分。有效成分为鱼腥草素、葵酰乙醛、月桂醛、月桂烯、甲基正壬酮等，还包括多酚类活性成分：蕺菜碱、槲皮素、槲皮苷、绿原酸、亚油酸等[11-13]。《中国兽药典》2015年版二部中收录的“鱼腥草注射液”主要以鱼腥草挥发油中的4-萜品醇、α-松油醇、甲基正壬酮和乙酸龙脑酯进行质量控制[14]。本研究发现，不同产地鱼腥草挥发油中4种有效成分含量存在很大差异，因此选取贵州省、四川省、广东省广州市、湖北省4地的鱼腥草进行比较分析，以期为鱼腥草的质量标准、资源评价及进一步的资源开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和药品 Trace1300气相色谱仪，赛默飞世尔；BT125D电子分析天平，赛多利斯。

4-萜品醇对照品，批号：111967-201501，中国食品药品检定研究院；α-松油醇，批号：111859-201503，中国食品药品检定研究院；甲基正壬酮，纯度≥99.8%，批号：110834-201603，中国食品药品检定研究院；乙酸龙脑酯，纯度≥99.6%，批号：110759-201105，中国食品药品检定研究院；正己烷，色谱纯，山东禹王化工公司；无水硫酸钠，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

鲜鱼腥草药材为湖北省、四川省、贵州省、广东省广州市4个产地实地采摘。

1.2 方法

1.2.1 鱼腥草挥发油提取 分别取湖北省、四川省、贵州省、广东省广州市4个产地鲜鱼腥草各 2 000 g，水蒸气蒸馏，收集初馏液2 000 mL，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液约1 000 mL，即得[14]。

1.2.2 供试品溶液的制备 精确量取鱼腥草蒸馏液60 mL，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水充满刻度部分，加入正己烷1.0 mL，连接回流冷凝管，加热至沸，保持微沸40 min，冷却至室温，分取正己烷层，加无水硫酸钠约0.4 g，振摇，正己烷液移至2 mL量瓶中，并用正己烷适量洗涤无水硫酸钠，洗涤液并入同一量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 对照品溶液的制备 甲基正壬酮对照品溶液：取甲基正壬酮对照品适量，精确称定，加正己烷制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。

混合对照品溶液：取4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮适量，精确称定，加正己烷制成每1 mL含0.25 mg的溶液。

1.2.4 GC色谱条件 色谱柱：DB-17MS毛细管气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升温：初始温度75 ℃，保持5 min，以5 ℃/min的速率升至150 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至250 ℃；进样口温度为250 ℃；检测器(FID)温度为250 ℃；流速为1 mL/min，分流进样，分流比：10 ∶1。理论板数按甲基正壬酮峰计算应大于10 000。

1.2.5 专属性考察 分别按照“1.2.2”节和“1.2.3”节的方法制备供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照溶液；精确吸取供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照溶液各1 μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。

1.2.6 线性关系考察 分别取4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮对照品适量，制成终质量浓度为1.5 mg/mL的混合对照品溶液，取此混合对照品溶液依次倍比稀释，分别制成质量浓度为0.75、0.38、0.19、0.09 mg/mL的溶液，各取1 μL进气相色谱仪检测，记录色谱图，以峰面积为纵坐标(y)，以对照品溶液的质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，计算每个成分的回归方程、相关系数和线性范围。

1.2.7 精密度考察

1.2.7.1 重复性试验 取鱼腥草蒸馏液按“1.2.2”节供试品溶液的制备项下方法平行制备供试品溶液6份，分别注入气相色谱仪，记录峰面积，计算RSD。

1.2.7.2 中间精密度试验 分别由3个试验人员，分别在3 d内，按“1.2.2”节方法制备供试品溶液，每人重复2次，分别进样分析，记录峰面积，计算RSD。

1.2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液于室温下放置0、2、4、8、12 h分别进样检测，记录峰面积，计算RSD。

1.2.9 准确度试验 分别制备相当于标示量80%、100%、120%的样品，每个质量浓度平行3个样品。按照含量测定项下方法制备样品测定，记录峰面积和色谱图，计算回收率。

1.2.10 不同产地鲜鱼腥草中活性成分评价 精确称取4个产地的鱼腥草蒸馏液60 mL各1份，按照“1.2.2”节方法制备供试品溶液，按照“1.2.3”节方法制备混合对照品溶液，分别精确吸取供试品溶液和对照品溶液各1 μL注入气相色谱仪，记录4种活性成分的峰面积，以外标法计算含量，对比4个产地鲜鱼腥草中活性成分的含量差异。

2 结果与分析

2.1 专属性考察结果

精确吸取供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照溶液各1 μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图(图1)，各成分保留时间和分离度见表1。由图1可见，阴性对照溶液色谱图中未见与对照溶液色谱图中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮相同保留时间的色谱峰，表明阴性无干扰。供试品和对照品溶液中4个成分的峰分离度良好。

表1 专属性考察结果

2.2 线性关系考察结果

分别取4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮对照品适量，制成终质量浓度为1.5 mg/mL的混合对照品溶液，取此混合对照品溶液依次倍比稀释，分别制成质量浓度为0.75、0.38、0.19、0.09 mg/mL 的溶液，各取1 μL进气相色谱仪检测，记录色谱图，以峰面积为纵坐标(y)，以对照品溶液的质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，每个成分的线性回归方程、相关系数和线性范围见表2，标准曲线见图2。由表2、图2可见，4种成分在0.1～1.5 mg/mL的范围内，相关系数均大于0.999，线性关系良好。

表2 鱼腥草四种化学成分的保留时间、回归方程、相关系数和线性范围

2.3 精密度考察结果

取鱼腥草蒸馏液平行制备供试品溶液6份，分别取1 μL进样检测，记录峰面积，计算RSD，测定结果见表3。从表3可以看出，测得样品中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮峰面积的RSD分别为0.98%、0.87%、1.83%、1.01%，表明本试验测定方法的重复性良好。分别由3个试验人员，分别在3 d内，制备供试品溶液，每人重复2次，分别进样分析，记录峰面积，计算RSD，结果见表4。由表4可见，测得4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮峰面积的RSD分别为1.33%，1.34%，1.32%，1.36%，表明本试验中间精密度良好。

表3 精密度考察的重复性试验结果

表4 中间精密度试验结果

2.4 样品放置稳定性考察结果

取同一份供试品溶液于室温下放置0、2、4、8、12 h分别进样检测，记录峰面积，计算RSD，计算结果见表5。从表5可以看出，不同时间点的4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮峰面积的RSD分别为1.35%、1.57%、1.30%、1.44%，表明供试品溶液在室温下放置12 h稳定。

2.5 准确度试验结果

分别制备相当于标示量80%、100%、120%的样品，每个浓度平行3个样品。测得峰面积，计算回收率见表6。

表5 样品放置稳定性考察试验结果

表6 鱼腥草4种化学成分准确度试验结果

2.6 不同产地鱼腥草4种成分测定结果

精确称取4个产地的的鱼腥草蒸馏液60 mL各1份，制备供试品溶液和混合对照品溶液，进样检测，记录色谱见图3，测定4种活性成分的峰面积，以外标法计算含量结果见表7。《中国兽药典》2015年版2部规定鱼腥草注射液中4-萜品醇/参照物(0.25 μg/μL)峰峰面积比值应不得低于0.15。从表7可以看出，湖北省、四川省、贵州省3个产地鱼腥草4-萜品醇含量均符合药典规定。其中以湖北地区鱼腥草挥发油中4种成分含量较高，尤其是 4-萜品醇含量；四川地区鱼腥草挥发油中则甲基正壬酮含量最为突出；贵州地区鱼腥草挥发油中 4-萜品醇、甲基正壬酮含量较高，但α-松油醇、乙酸龙脑酯含量明显低于其他地区；广东广州地区鱼腥草挥发油中4-萜品醇含量不符合药典规定，但甲基正壬酮含量较高，乙酸龙脑酯含量也高于贵州地区。总的来说，以湖北、四川地区鱼腥草质量较佳，4种主要成分含量相对较高。

表7 不同产地鱼腥草4种化学成分含量测定结果

3 讨论与结论

鱼腥草挥发性成分的含量与生长的气候条件和地域关系密切相关，不同产地鱼腥草药材挥发性成分的差别主要体现在物质的相对含量上，且差别较大，且活性成分与采摘时间也有很大关系[15]。选择品质优良，活性成分含量高的药材对于药物制剂品质和临床效果。《中国兽药典》2015年版二部收录了鱼腥草注射液质量标准，鱼腥草注射液应用鲜鱼腥草经水蒸气蒸馏获得的蒸馏液制备而成， 其质量标准中采用薄层色谱法确定样品中是否含有4-萜品醇、甲基正壬酮、α-松油醇，采用气相色谱法考察4个活性成分的特征图谱，以甲基正壬酮为参照物，以峰面积比值不低于0.15定量。

仅应用薄层色谱法鉴别，气相色谱法考察特征图谱，难以精确区分不同产地鱼腥草药材挥发性成分的差异，因此本研究在鱼腥草注射液质量标准特征图谱考察方法的基础上，建立了4-萜品醇、甲基正壬酮、α-松油醇、乙酸龙脑酯4种活性成分含量精密测定的气相色谱法，选择外标法定量，并参照《兽药质量标准分析方法验证指导原则》相关要求对所建方法进行了验证，结果表明，该方法4种活性成分色谱峰之间，与其他杂质峰之间均能有效分离，专属性良好；4种活性成分在0.1～1.5 mg/mL的范围内，相关系数均大于0.999，线性关系优良；方法重复性试验样品中4个成分平均RSD≤1.2%，中间精密度试验样品中4个成分平均RSD≤1.3%，精密度好，回收率在80%～120%，准确度高；适用于鲜鱼腥草蒸馏液中4种活性成分含量的测定。对鲜鱼腥草活性成分精准定量，不仅能很好地表征药材的差异性，还有助于准确找到引起这种差异的特征物质，为中药质量控制提供了有用的基础信息。

本试验采用建立的方法对湖北、四川、贵州、广东广州地区鱼腥草挥发油中4种主要成分4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮的含量进行测定，并进行了对比分析。《中国兽药典》2015年版二部规定鱼腥草注射液中4-萜品醇/参照物(0.25 μg/μL)峰面积比值应不得低于0.15。含量测定结果显示，湖北、四川、贵州3个产地鱼腥草 4- 萜品醇含量均符合药典规定。但不同产地鱼腥草挥发油中4种主要成分存在很大差异，其中以湖北地区鱼腥草挥发油中4种成分含量普遍较高，尤其是4-萜品醇含量；四川地区鱼腥草挥发油中则甲基正壬酮含量最为突出；贵州地区鱼腥草挥发油中4-萜品醇和甲基正壬酮含量较高，但α-松油醇、乙酸龙脑酯含量明显低于其他地区；广东广州地区鱼腥草挥发油中4-萜品醇含量不符合药典规定，但甲基正壬酮含量较高，乙酸龙脑酯含量也高于贵州地区。总的来说，以湖北、四川地区鱼腥草质量较佳，4种主要成分含量相对较高。本研究结果为鱼腥草注射液药材选择、鱼腥草药材内在质量的综合评价和全面控制提供了一定的参考依据。