能够快速固定重金属的复合发酵菌液的制备及应用

刘亚平

(河北省地质环境监测院/河北省地质资源环境监测与保护重点实验室，河北石家庄 050000)

1 材料与方法

1.1 试验材料

巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，前者具有碳酸盐矿化功能，本研究中将其命名为菌株A1，后者具有磷酸盐矿化功能，本研究中将其命名为菌株A2，通用下文。

碳酸盐矿化菌培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠5 g/L，尿素20 g/L，调节pH值至 7.2～7.4，尿素需配制成尿素溶液后加入培养基中，因尿素高温易变性，影响试验结果。

磷酸盐矿化菌培养基：植酸钠1 g/L，牛肉膏 3 g/L，氯化钠5 g/L，蛋白胨5 g/L，调节pH值至7.0～7.2，于121 ℃下高温高压灭菌25 min。

LB固体培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠 5 g/L，调节pH值至7.0～7.2，121 ℃下高温高压灭菌25 min。

供试土壤：采自河北省涞源县独立山城矿开发园区(114°29′24.52″E，39°13′42.14″N)，基本理化性质：pH值为 6.23，总氮含量101.2 mg/kg，速效磷含量23.8 mg/kg，速效钾含量232.5 mg/kg，有机质含量4.36%，总Cu含量 257 mg/kg，有效态Cu含量84.5 mg/kg。以下土培试验均用此供试土壤。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液的制备 首先将菌株A1、A2的菌体细胞分别划线于LB固体培养基上，在28 ℃下培养24 h，然后向长满菌体细胞的平板中加入无菌水，用烧红灭菌过的接种环将菌体细胞刮离固体培养基进入无菌水中，将含有菌体细胞的悬浊液倒入离心管中，在涡旋振荡器上振荡均匀后，再用无菌水分别将2种菌株清洗离心，反复3次，最后将菌株A1和A2的菌悬液D600 nm调节为0.3左右，即为试验用菌悬液。该菌悬液用于以下的所有接种试验。

1.2.2 单一或复合发酵菌液的制备 发酵菌液A1的制备：将目标菌株A1接种至碳酸盐矿化菌培养基中，置于28 ℃、160 r/min的恒温摇床中进行振荡培养，培养36 h后，发酵菌液A1制备完成。

发酵菌液A2的制备：将目标菌株A2接种至磷酸盐矿化菌培养基中，置于28 ℃、160 r/min的恒温摇床中振荡培养，培养36 h后，发酵菌液A2制备完成。

复合发酵菌液的制备：将发酵菌液A1和A2按一定比例混合，制备成复合发酵菌液。

1.2.3 单一发酵菌液和复合发酵菌液对Cu2+的去除 向 20 mL 质量浓度为40 mg/L的氯化铜溶液中分别加入10、20、40 mL 发酵菌液A1、发酵菌液A2和复合发酵菌液，分别在室温下沉淀12 h后，过 0.45 μm 滤膜，利用原子吸收分光光度计测定滤液中Cu2+含量，计算去除率。去除率=(去除前Cu2+质量浓度-去除后Cu2+质量浓度)/去除前Cu2+质量浓度×100%。

1.2.4 发酵菌液的混合比例对重金属去除的影响 将菌株A1和A2的发酵菌液分别按1 ∶4、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1和4 ∶1的体积比混合均匀，制备成复合发酵菌液。将各混合比例的复合发酵菌液按照与含Cu2+溶液体积比为2 ∶1的比例分别加入到Cu2+溶液中，室温下沉淀12 h后，过滤，测定上清液中的Cu2+质量浓度，分别计算去除率。

1.2.5 不同初始Cu2+质量浓度对去除效果的影响 经前期大量试验验证，得出在复合发酵菌液 A1 ∶A2 的体积比为2 ∶1时，去除效果最佳。因此，将 20 mL 体积比为2 ∶1的复合发酵菌液分别加入到10 mL Cu2+质量浓度为10、20、40、60 mg/L的Cu溶液中，混合均匀，室温下沉淀12 h后，测定上清液中Cu2+质量浓度，计算去除率。

1.2.6 沉淀时间对复合菌液去除Cu2+的影响 将20 mL A1 ∶A2 体积比为2 ∶1的复合发酵菌液加入到10 mL Cu2+质量浓度为40 mg/L的Cu溶液中，混合均匀，在室温下分别沉淀0、6、12、18、24、30、36 h 后(分别做3组平行试验，共15个小三角瓶)，测定上清液中Cu2+质量浓度，并计算去除率。

1.2.7 温度对复合发酵菌液去除Cu2+效果的影响 将 20 mL A1 ∶A2体积比为2 ∶1的复合发酵菌液加入到10 mL Cu2+质量浓度为40 mg/L的Cu溶液中，混合均匀后分别在4、21(室温)、50 ℃下沉淀 24 h 后，测定上清液中Cu2+质量浓度，计算去除率。

1.2.8 单一和复合发酵菌液对土壤中有效态重金属的固定 称取100 g土壤平整铺入小花盆中，按照土液比2 g ∶1 mL的比例分别加入50 mL发酵菌液A1、50 mL发酵菌液A2及50 mL复合发酵菌液，并搅拌均匀，期间按照正常的水肥管理方法进行管理。分别在培养0、3、6、9、12、15 d后取样，测定土壤中有效态Cu含量，比较单一或复合发酵菌液对土壤中有效态Cu的固定效果。

1.2.9 测定方法 土壤中有效态Cu的测定：利用DTPA法浸提出土壤中有效态的Cu，用0.45 μm针式过滤器过滤后，用空气乙炔原子吸收分光光度计测定[14]。

溶液中Cu2+的测定：将溶液过0.45 μm针式过滤器，然后用原子吸收分光光度计测定Cu2+质量浓度。

1.3 数据处理与分析

所有试验重复3次，试验数据利用Excel 2010进行处理，用“平均值±标准差”表示，用DPS 7.05软件进行误差分析。

2 结果与分析

2.1 单一和复合发酵菌液对Cu2+的去除

从图1中可以看出，无论加入量多少，复合发酵菌液对Cu2+的去除率均高于单一发酵菌液的去除率，且加入量为40 mL(菌液与重金属溶液体积比为2 ∶1)时，去除效率最高，可达到96.4%。

2.2 发酵菌液的混合比例对Cu2+去除的影响

从图2中可以看出，发酵菌液随着A1占比增大，对Cu2+的去除率逐渐增加，当发酵菌液A1 ∶A2体积比为2 ∶1时，溶液中Cu2+的去除率可达到最大，为98%，A1占比继续增大时，去除率反而会呈现降低趋势。

2.3 不同初始Cu2+质量浓度对去除效果的影响

从图3中可以看出，随着Cu2+初始质量浓度的增加，复合发酵菌液对其去除率呈现先升高后降低的趋势，当初始质量浓度为40 mg/L时，去除率达到最大，为96.8%。但当初始质量浓度更大时，发酵菌液对溶液中Cu2+的去除率则出现下降趋势。

2.4 沉淀时间对去除Cu2+的影响

由图4中可以看出，复合发酵菌液对Cu2+的去除率随着沉淀时间的延长而不断增大，到24 h时达到最大，最大去除率可达到98%以上，随后去除率趋于稳定。

2.5 温度对复合发酵菌液去除Cu2+效果的影响

从图5中可以看出，高温下的去除率高于低温时，且增幅为17.7%，室温下的去除率和高温时相差无几，说明只有低温会抑制复合发酵菌液对Cu2+的去除作用。

2.6 单一和复合发酵菌液对土壤中有效态重金属的固定

从图6中可以看出，复合发酵菌液对土壤中有效态Cu的固定效果高于单一发酵菌液，在培养3～9 d快速固定有效态Cu，且在15 d内，复合发酵菌液对有效态Cu的固定率可达到80.26%，分别高出单一A1、A2发酵菌液固定率13.04%、17.45%。

3 讨论与结论

自然界中的很多微生物都具有固定重金属的能力，但能够固定后使其稳定不释放的方法不多见，而当前大多数学者都把目光集中在了如何使土壤或者水体中的重金属失去毒性，保持其原有的微量元素的可利用性。但暂时的使重金属失去毒性很容易，要长期稳定地保持这种效果就比较难处理。一些专家学者利用微生物的吸附、吸收或者胞吞作用去除重金属的危害，这样的方式效果很明显，但一段时间后，随着细胞的死亡，重金属被重新释放，再次污染水体或者土壤。随着研究的不断深入，已经有一些研究发现了能够有效固定重金属，且能保持一段时间内不会因为自然环境的改变或者细胞的死亡而重新造成毒害作用的方法——生物矿化法[15]。目前已有一些关于生物矿化作用的研究成果，如钱春香等研究了一株枯草芽孢杆菌的碳酸盐矿化作用对Cu2+的去除机制，结果表明，在碱性条件下更利于生物矿化作用的产生且产生的矿化产物更加稳定[12]。之后，钱春香团队的王明明等利用国外进购的具有磷酸盐矿化作用的菌株，对Zn2+的生物矿化作用机制进行研究，结果也表明了碱性条件是产生生物矿化作用的重要因素，在碱性环境下能够生成较稳定的产物[11]。但目前的研究仍停留在单一碳酸盐矿化作用或磷酸盐矿化作用，复合的矿化效果是否会更好还没有被具体报道。因此，本文利用能够碳酸盐矿化的巨大芽孢杆菌和能够磷酸盐矿化的枯草芽孢杆菌进行了复合矿化效果研究，结果表明复合发酵菌液的效果确实会高于单一发酵菌液，且在菌液A1 ∶A2体积比为2 ∶1时矿化效果最好。随后又研究了初始Cu2+质量浓度、沉淀时间和温度对矿化效果的影响，从而发现初始质量浓度越大，矿化效果越好，但在Cu2+质量浓度超过40 mg/L时，矿化效果会受到抑制作用；矿化效果也会随着时间的延长越来越好，当沉淀时间超过24 h后逐渐趋于稳定，无明显变化；在温度越高时，矿化效果越好。最后，研究了单一和复合发酵菌液对土壤中有效态Cu的固定效果，通过土培试验得知，复合发酵菌液对土壤中有效态Cu的固定效果高于单一发酵菌液，且在15 d内，复合发酵菌液对有效态Cu的固定率可达到 80.26%。以上所有研究表明，复合发酵菌液的生物矿化作用高于单一发酵菌液，但复合发酵菌液中的单一因素如何共同对重金属离子产生生物矿化作用还在进一步研究。

综上所述，本研究可得出以下结论：复合发酵菌液对Cu2+的矿化效果高于单一的，且在发酵菌液A1 ∶A2体积比为2 ∶1时矿化效果最好。分别在Cu2+初始质量浓度为40 mg/L、沉淀时间为24 h和高温时，复合发酵菌液对Cu2+的矿化效果最好，Cu2+的最大去除率可分别达到96.8%、98.4%和98.1%。土培试验表明，复合发酵菌液对土壤中有效态Cu的固定作用高于单一发酵菌液的作用，且15 d内固定率可达到80.26%。