镉、铅复合污染条件下印度芥菜的根际特征研究

刘 巧， 张敏硕， 王小敏， 刘博扬， 高夕彤， 李博文， 郭艳杰

(1.河北农业大学资源与环境科学学院，河北保定 071001； 2. 河北省蔬菜产业协同创新中心，河北保定 071001； 3.河北省农田生态环境重点实验室，河北保定 071001)

近年来新兴起的植物修复(phytoremediation)技术，因具有投资少、不破坏场地结构、不引起二次污染等优点，被认为是目前修复重金属污染土壤最有前途和发展前景的治理技术[1]。该技术的运用前提是找到对某种或某些重金属有特殊富集能力的超富集植物(hyperaccumulator)。大部分重金属在土壤中的生物有效性较低，能够被植物利用的部分很少，而与一般植物相比，超富集植物具有超常的吸收、转运和富集重金属的能力[2-3]，这就意味着超富集植物应该能够强烈活化和溶解根际环境的难溶态重金属。通过一些试验发现，在重金属污染土壤上种植遏蓝菜(Thlaspicaerulescens)，土壤孔隙应用水溶态锌的降低量仅占T.caerulescens总吸收量的1%[4]，即T.caerulescens吸收和积累的Zn绝大部分来自土壤中非可溶性部分；铊超富集植物雨衣甘蓝(Brassicaoleraceaacephala)和屈草花属植物(Iberisintermedia)地上部吸收的铊18%和21%来自根际土壤(0～2 cm土层)的植物有效态部分，而50%和40%来自非可溶性部分[5]。这些研究结果表明，超富集植物确实具有特殊的活化土壤中一般植物不能吸收利用的重金属的能力，因而进一步推测，超富集植物的这种特性是由其本身特殊的根系特性和根际环境造成的。在重金属胁迫下，超富集植物根系分泌特殊的有机物，诱导缓效态或非有效态重金属大量溶解和释放；同时在植物根际，由于有较高浓度的碳水化合物、氨基酸、维生素和其他生长因子存在，成为微生物活动旺盛的区域。Abou-Shanab 等研究发现，Ni超积累植物香雪球(Allysummurale)的根际环境中可培养的细菌、放线菌和真菌数量以及耐Ni细菌和产酸细菌的比例均显著高于非根际土壤[6]。微生物通过对重金属元素进行价态转化或通过刺激植物根系的生长发育影响植物对重金属的吸收，同时微生物能通过产生有机酸、提供质子及与重金属络合的有机阴离子[7]，从而对土壤中重金属的固定活化产生重要影响[8]。由于根际环境中的物理、化学、生物学特性或效应直接影响重金属的固定和活化状态，关系到重金属在土壤-植物系统中的迁移转化行为，如今关于根际环境的研究已经成为超富集植物一个新的研究热点[9]。

印度芥菜(Brassicajuncea)是目前筛选出来的一种生长快、生物量较大的Cd、Zn、Pb忍耐-富集型植物，在植物修复中具有较大的应用潜力[10-11]。有关印度芥菜的研究目前主要集中在其吸收富集重金属的能力和修复重金属污染土壤效率以及强化吸收措施等方面[12-13]。而对于印度芥菜根际环境特征，即印度芥菜吸收富集重金属的机制研究还不够完善。因此，本试验运用2因素(Cd、Pb)5水平回归正交设计，采用根袋试验法，种植对重金属有富集作用的印度芥菜，同时设非富集植物油菜为参比植物，通过对比分析的方法，初步探讨在Cd、Pb复合污染碱性土壤条件下印度芥菜的根际环境特征。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物 供试植物为印度芥菜(Brassicajuncea)，品种为WildGardenPungentMix，从国外购买。参比植物为青帮油菜，购于河北省保定市农资科技市场。

1.1.2 供试土壤 供试土壤为河北农业大学西校区标本园的潮褐土(0～20 cm土层)。土壤基本理化性质见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 试验方案 试验方案采用Cd、Pb 2因素5水平回归正交设计，共11个处理，每个处理设3次重复，重金属Cd、Pb分别以(CH3COO)2Cd·2H2O和(CH3COO)2Pb·2H2O固体粉末形式施入土壤，具体添加量见表2。

表1 供试土壤基本理化性质

注：pH值在水土比为1 g ∶2.5 mL的条件下测定得到。

表2 供试土壤重金属添加量

注：p代表因素数；m代表重复数；x1、x2分别代表各因素的编码值。

1.2.2 试验布置 采用上、下口径分别为13、10 cm，高10 cm的塑料盆盛过3 mm筛的风干土，每盆装土800 g，重金属按照试验方案拟定的处理量装盆，同时每盆施入0.26 g尿素和0.32 g磷酸二胺作底肥。将重金属、底肥和土壤混匀，用300目的尼龙网做成根袋，将200 g混匀土装入根袋作为根际土，600 g混匀土装入塑料盆内，置于根袋外围作为非根际土，在60%田间持水量下平衡1个月后播入印度芥菜种子，每盆定苗6株(植物全部在根袋内定植)，生长约60 d后收获。参比植物油菜的处理方式与印度芥菜相同。

1.2.3 样品的采集和处理 采集根袋内土样，取适量风干后过筛备用。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化指标的测定 供试土壤的基本理化性质采用常规分析方法[14]测定。

1.3.2 土壤重金属含量分析 土壤中重金属Cd、Pb总量用王水-高氯酸消解，消解液过滤后，原子吸收法[15]测定；土壤中有效态Cd、Pb含量采用二乙基三胺五乙酸(DTPA)提取剂[0.005 mol/L DTPA+0.1 mol/L三乙胺(TEA)+0.01 mol/L CaCl2]浸提-原子吸收法[16]测定。

1.3.2 土壤pH值的测定 称取过2 mm筛风干土样 10.00 g 于50 mL烧杯中，加入0.01 mol/L CaCl2溶液25 mL(土水比为1 g ∶2.5 mL)，搅拌1～2 min，并放置30 min后用 PHS-3C数字酸度计直接测定pH值。

1.3.3 土壤中微生物数量的测定 土壤微生物(细菌、放线菌、真菌)数量采用平板稀释法测定。细菌、放线菌和真菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和查氏培养基培养[17]。

1.4 数据处理

所有结果均为3次重复的平均值，采用Excel 2003作图，SPSS 11.5软件进行方差分析、相关分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 Cd、Pb复合污染处理印度芥菜和油菜根际土壤中有效态Cd、Pb含量

2.1.1 印度芥菜和油菜根际土壤中有效态Cd含量 从表3可以看出，在本试验的11个处理中，随着土壤中Cd添加量的增加，印度芥菜和油菜根际土壤中有效态Cd含量均显著增加(P<0.05)，印度芥菜、油菜根际土壤中有效态Cd含量最大值分别达到了141.78、117.01 mg/kg。但相比较而言，除处理5外，其余处理印度芥菜根际土壤中有效态Cd含量明显高于同处理下油菜根际土壤，是同处理下油菜根际土壤中有效态Cd含量的1～6倍，这就表明，与普通植物相比，印度芥菜根系或其根系分泌物对土壤中难溶态Cd有很强的活化作用。处理5中虽然外源Cd的添加量达到了最大值 200 mg/kg，但印度芥菜根际土壤中有效态Cd含量与油菜根际土壤相差不多，从数值上看，印度芥菜根系对土壤中Cd并未表现出较强的活化效应。这可能是由于植物根际土壤中Cd的生物有效性受到了共存元素Pb的影响，Pb会夺取Cd在土壤中的吸附位而提高土壤中Cd的生物有效性，或者取代根中吸附的Cd，提高根中滞留Cd的活性，使Cd进一步向地上部转移[18]。同时研究认为，植物对重金属的吸收及重金属的毒性与其在土壤中存在的有效态含量有密切的相关性[19]。印度芥菜是公认的Cd富集植物，并且吸收的Cd有71%～82%富集在地上部[20]，这使得土壤中大量有效态Cd被印度芥菜吸收并富集在地上部；而油菜对Cd的吸收和富集能力相对较差，土壤中有效态Cd不能被油菜大量吸收而留在土壤中。因此在处理5下印度芥菜和油菜根际土壤中有效态Cd含量相差不多，同时这间接反映了印度芥菜通过根际效应确实对土壤中难溶态Cd具有很强的活化和吸收富集能力，这对于修复重金属Cd污染土壤具有重要意义。

2.1.2 印度芥菜和油菜根际土壤中有效态Pb含量 从表3可以看出，随着土壤中Pb添加量的增加，各处理印度芥菜和油菜根际土壤中有效态Pb含量均显著增加(P<0.05)。当外源Pb的添加量为最大值1 000 mg/kg时，印度芥菜和油菜根际土壤中有效态Pb含量也都达到了最大值，分别为 828.25 mg/kg 和601.02 mg/kg。这可能是由于在重金属胁迫下，植物根系分泌了一些物质，如柠檬酸、苹果酸、乙酸、乳酸等，这些可物质与Pb离子形成可溶性络合物，进而抑制Pb跨膜运输，增加Pb在根际土壤中的移动性[21]，也可能是由于根际土壤中微生物的活动作用对Pb的活化有显著影响，但其作用机制还有待进一步深入研究。除处理3外，其余各处理印度芥菜根际土壤中有效态Pb含量都明显高于同处理下油菜根际土壤，是相同处理下油菜根际土壤中有效态Pb含量的1～3倍，说明印度芥菜根系对土壤中Pb也有较强的活化效应。处理3中印度芥菜根际土壤中有效态Pb含量与油菜根际土壤相比低11.68%，这可能和植物的特性以及Cd、Pb在土壤中复杂的相互作用有关。印度芥菜吸收土壤中的有效态Pb并将其主要富集在根系[12]，而中低浓度的Cd(Cd添加量为12.82 mg/kg)处理对油菜吸收Pb具有拮抗作用[22]，从而使得根际土壤中有效态Pb含量大于印度芥菜根际土壤。这同样也反映了印度芥菜对土壤中难溶态Pb的活化和吸收能力强于普通油菜。

表3 Cd、Pb复合污染处理印度芥菜和油菜根际土壤中有效态Cd、Pb含量

注：同列数据后不同小写字母表示处理间在5%水平上差异显著。

2.2 Cd、Pb复合污染处理印度芥菜和油菜根际土壤pH值的变化

土壤pH值是影响土壤重金属元素生物有效性的主要因子。目前研究认为，根际土壤pH值的变化主要是由根系呼吸作用释放CO2以及在离子的主动吸收和根尖细胞伸长过程中分泌质子和有机酸所致[23]。从图1可以看出，随着Cd、Pb的加入，除处理4和处理11印度芥菜根际土壤pH值都有所降低外，其余处理土壤pH值无明显变化，这可能是由于试验用的土壤为pH值8.28的石灰性土壤，对印度芥菜根系分泌的有机酸等有很强的缓冲性。除处理8和处理10外，油菜根际土壤pH值随着Cd、Pb的加入有增加趋势，但各处理间差异不明显，这可能是由于在Cd、Pb复合污染胁迫下，重金属对油菜根系H+的分泌具有抑制作用[24]，使得pH值有所升高，降低了重金属的迁移能力，减弱其毒性，同时增强了油菜耐重金属的能力[25]。在相同Cd、Pb复合污染处理下，印度芥菜根际土壤pH值均明显低于油菜根际土壤，成对t检验结果显示，差异达到极显著性水平。这说明，与一般植物相比，富集植物印度芥菜自身根系能够释放质子和有机酸，导致根际酸化，pH值有所降低，这对于根际土壤重金属保持较高的生物有效性或促进重金属活化是非常有利的，从“2.1”节的结果分析也可以看出，在大多处理下印度芥菜根际土壤有效态重金属含量明显高于油菜根际土壤。

2.3 Cd、Pb复合污染处理印度芥菜和油菜根际土壤微生物的数量分析

2.3.1 印度芥菜和油菜根际土壤细菌数量的变化 从表4可以看出，印度芥菜和油菜根际土壤细菌的数量与Cd、Pb复合污染的处理浓度有关。印度芥菜根际土壤细菌数量的变幅为1.04×108～3.54×108个/g，平均为2.36×108个/g；油菜根际土壤细菌数量的变幅为0.72×107～4.40×107个/g，平均为2.66×107个/g。印度芥菜根际土壤细菌数量约为同处理油菜根际土壤的4～26倍，两者差异较大，通过成对t检验显示，差异达极显著性水平。这可能是由于印度芥菜特有的根际环境效应，造成土壤中细菌生长所需的有机物质增加，从而导致了对Cd、Pb非敏感性细菌数量的上升，也可能是由于重金属的胁迫效应造成细菌的生理生化特性发生变异，从而使数量增加。

2.3.2 印度芥菜和油菜根际放线菌数量的变化 在Cd、Pb复合污染处理下，印度芥菜和油菜根际土壤中放线菌的数量明显小于细菌(表4)。印度芥菜根际土壤中放线菌数量的变幅为2.37×106～5.44×106个/g，平均为3.81×106个/g；油菜根际土壤中放线菌数量的变幅为0.89×106～3.37×106个/g，平均为1.69×106个/g。印度芥菜根际土壤放线菌数量均比同处理油菜根际放线菌数量要高，但二者差异不大。

2.3.3 印度芥菜和油菜真菌数量的变化 由表4可知，在Cd、Pb复合污染处理下，印度芥菜和油菜根际土壤中真菌的数量比细菌、放线菌少。印度芥菜根际土壤中真菌数量的变幅为2.25×105～6.50×105个/g，平均为4.46×105个/g；油菜根际土壤中真菌数量的变幅为2.57×104～3.60×104个/g，平均为2.91×104个/g。印度芥菜根际土壤真菌数量约为同处理油菜根际真菌数量的3～24倍，通过成对t检验显示，差异达极显著水平。

由表4还可以看出，在Cd、Pb复合污染处理下，印度芥菜和油菜根际土壤中，均为细菌数量最多，数量级分别为108个/g和107个/g，其次是放线菌，数量级均为106个/g，真菌数量最小，数量级分别为105个/g和104个/g。但相比较而言，印度芥菜根际土壤中细菌和真菌的数量显著高于油菜，这是由于富集植物印度芥菜在其根系分泌物作用下，降低了根际土壤环境的pH值，促进了细菌和真菌的生长[26]，同时根系分泌物为土壤微生物提供了生长所需的碳源和能源物质，从而促进了根际微生物的生长，并提高了其活性，部分减缓了重金属对土壤微生物的抑制作用[27]。这与前人的一些研究结果相类似，如Delorme等报道Zn超富集植物遏蓝菜(Thlaspicaerulescens)比非富集植物红车轴草(Trifoliumpratense)根际土壤具有更多的耐重金属细菌和真菌[28]。李廷强等的研究结果也表明，超富集生态型东南景天根际土壤中细菌和真菌数量显著高于非超富集生态型[29]。这说明印度芥菜特殊的根际特征为土壤中微生物的生长和繁殖提供了适应的生存环境，导致对重金属胁迫适应性强的微生物种群和群落结构形成，这些耐性微生物在印度芥菜根际重金属的活化和溶解过程中起重要作用，并且试验表明，起作用的耐性微生物主要是细菌和真菌，放线菌的作用不是主要的。有关这些耐性微生物的分离鉴定及其在印度芥菜根际土壤重金属活化和溶解过程中的作用机制还需进一步深入研究。

表4 不同Cd、Pb复合污染处理印度芥菜和油菜根际土壤微生物的数量

3 结论

本研究中，在Cd、Pb复合污染条件下，印度芥菜对土壤中难溶态Cd、Pb具有很强的活化和溶解能力。富集植物印度芥菜根际土壤pH值显著低于同处理油菜，根际土壤中细菌和真菌的数量显著高于同处理油菜，对于放线菌数量，二者之间差异不大，细菌和真菌在印度芥菜根际重金属的活化和溶解过程中起主要作用。因此，与普通植物相比，富集植物印度芥菜根系向根际分泌一些质子、金属结合体[金属硫蛋白(MTs)、植物螯合肽(PCs)]或有机物如有机酸等，导致根际土壤酸化，pH值降低，同时在重金属胁迫下，印度芥菜根际土壤中耐性细菌和真菌的数量增加，甚至可能导致一些特殊的微生物区系存在。在根系分泌物和根际微生物的共同作用下所形成的特殊根际环境，使印度芥菜具有能够强烈活化和溶解土壤中重金属的能力，是其能够超富集重金属的根本原因。