氮磷配施对小麦生长、叶片叶绿素含量及叶绿素荧光特性的影响

武悦萱,张 辉,王苗苗,景 琦,校思泽,张蓓蓓

(陕西省灾害监测与机理模拟重点试验室/宝鸡文理学院 地理与环境学院,陕西 宝鸡 721013)

0 前言

与植物外在的直观表现相比,叶绿素荧光参数更加能够反映植物的内部变化和植物的生长状况；通过叶绿素荧光动力学可以在不损伤植物的情况下测试植物叶片的光合反应速率和受胁迫的状态。植物经过暗适应后暴露在可见光下,荧光值会随时间有所变化,形成的曲线就是叶绿素荧光诱导曲线[1]。该曲线能够反映植物光化学反应中心PSⅡ的初始光化学反应速率以及植物的光化学反应状态[2-3]。植物的生长发育离不开光合作用,光合作用是生物界所有物质代谢和能量代谢的物质基础[4]。植物光合作用的主要场所是叶绿体,叶绿素a、b的含量影响着植物光合作用的快慢。叶绿素含量与叶绿素荧光参数相结合能够更加准确地反映植物的生长状态。

小麦是黄土高原上的主要农作物,作为被世界上广泛种植的禾本科植物,氮磷配施对小麦生长、生理的影响一直受到全球学者们的关注[5-6]。其中Araya A作了灌溉及氮磷施用量对小麦产量、生物量和产量的影响的研究[7]。龚明强等的研究结果表明合理配施氮、磷、钾肥对土壤养分有一定的改善作用,能提高土壤的有机质含量,小麦各器官中的氮含量相对于单一施肥明显增高,经济产量明显提高[8]。还有研究表明土壤肥力能够显著提高小麦产量[9-10]。但前人对于小麦旗叶叶绿素荧光特性的研究多集中在同一土壤肥力条件下进行[11]。施加氮肥和磷肥是提高旱地小麦产量的有效措施,増施氮磷肥料可以促进小麦的生长和分蘖[5，12-13]；可以促进小麦根系下扎,增强对深层土壤水分的吸收能力,提高抗旱性,进而提高产量[14-15]。因此考虑到氮肥、磷肥的浓度对小麦生长期的双重因素影响,本试验采用叶绿素荧光分析技术,对小麦品种“九麦2号”施加5组氮磷浓度不同的处理,研究了不同氮磷配施浓度对“九麦2号”叶片生长及生理指标的影响,以期为小麦拔节期筛选出更佳的氮磷配施方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料及过程

试验小麦品种为“九麦2号”,选取颗粒饱满的小麦种子用于试验。试验使用直径25 cm、高20 cm的花盆，盆中装入宝鸡地区的农田土壤,每盆播种10颗小麦种子；花盆土壤质地基础氮含量为0.779 g/kg,磷含量为1.086 g/kg。处理设置如表1所示,每个处理有3个重复和1个空白对照。所有盆栽于2018年10月15日放置在Fytoscope人工培养箱内,设置光暗时间16 h/8 h,昼夜温度25/15 ℃；每天称重两次,进行补水,保证土壤湿度为75%(v/v)。

表1 试验处理及施肥量kg/hm2

1.2 测定方法

1.2.1 小麦叶片生长参数的测定 比叶面积(SLA)的测定:选择拔节期旗叶进行测定,每盆选取3张叶片。用尺子测量叶片的长和宽,计算叶面积[叶面积=0.75×叶长(cm)×叶宽(cm)]。将叶片装入信封,于80 ℃烘箱中烘干48 h,烘至恒重。计算比叶面积[SLA=叶面积(cm2)/叶重(g)]。

叶片相对含水量(RWC)的测定:称量小麦旗叶鲜重(FW);使用去离子水浸泡24 h,然后用滤纸擦干，称量饱和重(TW)；最后称量烘干至恒重的旗叶干重(DW)。计算叶片相对含水量，其计算公式为：叶片相对含水量=(FW-DW)×100/(TW-DW)。

水分利用效率(WUE)的测定:水分利用效率为植物生长期间的耗水量(g)与植物干重(kg)的比值。

1.2.2 叶片叶绿素含量的测定 先将生长到拔节期的小麦叶片剪下,再将洗净、擦干的新鲜叶片剪碎,用电子天平称取0.1 g,装入25 mL试管中,立即加入丙酮-无水乙醇混合浸提液,定容至25 mL,盖上瓶塞;置于40 ℃温箱中遮光浸提约24 h;24 h后可以看到剪碎的叶片呈白色,溶液呈绿色,将其冷却到室温后,用提取液定容到刻度处;摇匀后即可用于叶绿素含量的测定,设3个重复。将叶绿素浸提液摇匀后倒入干净的比色杯中,用722型分光光度计分别在波长645、663 nm处测定并记录光密度值,测定时以混合浸提液作为对照。根据测得的光密度值,计算出小麦叶片每克鲜重含叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的毫克数(mg/g)。计算公式如下：

Ca=12.71A663-2.59A645

(1)

Cb=22.88A645-4.67A663

(2)

C=Ca+Cb=20.29A645+8.04A663

(3)

叶绿素a含量(mg/g)=Ca×V/W

(4)

叶绿素b含量(mg/g)=Cb×V/W

(5)

叶绿素总量(mg/g)=C×V/W

(6)

上式中：V为提取液的体积(L);W为材料的鲜重(g)。

1.2.3 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线和参数的测定 在小麦拔节期间,于上午9:00时,随机选取各处理的小麦叶片,首先进行20 min暗适应,然后利用德国Walz公司生产的Mini-Imaging-PAM叶绿素荧光仪进行荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线的测定,测定出不同光强下的实时荧光值。重复测定3次，取平均值绘制OJIP曲线。进行比对分析，得到的参数分别有：最小荧光强度Fo;最大荧光Fm;PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm;捕获光能与热耗散能量的比例Fv/Fo;OJIP荧光诱导曲线初始斜率Mo;单位反应中心捕获的能量DIo/RC;PSⅡ捕获能量从QA传递到QB的效率ψo;用于电子传递量子产额ΦEo;以吸收光能为基础的性能指数(PIabs)等。

1.3 数据处理

利用Excel 2010进行基础数据整理;用SPSS 19.0进行one way-ANOVA分析[16],用LSD法进行差异显著性检验和多重比较;采用Origin 8.0作图[17]。

2 结果与分析

2.1 氮磷配施对小麦旗叶比叶面积和相对含水量的影响

由图1可以看出：叶片比叶面积(SLA)和叶片相对含水量(RWC)的变化趋势基本相同,均在处理T3下最高。具体而言，T3处理下的比叶面积最高,显著高于T1、T5,分别比T1、T5高31.96%和14.90%。T3处理下的叶片相对含水量显著高于T1、T5,分别比T1和T5高3.68%和3.21%。

图1 氮磷配施对小麦旗叶比叶面积和相对含水量的影响

2.2 氮磷配施对小麦叶片叶绿素含量的影响

叶绿素含量会影响叶片光合作用的能力。从表2中可以看出,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量随着氮磷浓度梯度的增加具有一个先升高后降低的趋势,且不同氮磷浓度处理下的小麦叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量及叶绿素a/b有显著差异。在T2处理下,总叶绿素含量最高,说明叶片叶绿体可以吸收更多的光能,光合效能较强。在T2处理下叶绿素a含量分别高出T1、T3、T4和T5处理46.99%、7.10%、20.77%和44.26%(P<0.05)。在T2处理下叶绿素b含量比T1、T3、T4和T5处理分别高出50.00%、4.55%、20.45%和47.73%(P<0.05)。叶绿素a/b可以反映捕光色素复合体Ⅱ在总叶绿体结构中所占的比例,说明捕光能力的强弱。从表2中可以看出5个处理间叶绿素a/b值无显著差异,F值为1.38。

表2 氮磷梯度处理对小麦拔节期叶绿素含量的影响

注:表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

2.3 氮磷配施对土培小麦旗叶叶绿素荧光特性的影响

2.3.1 对小麦旗叶Fo和Fm的影响 由图2可以看出,不同氮磷配施浓度处理下的小麦拔节期叶片从T1到T5的初始荧光值(Fo)呈上升趋势,最高值出现在T5,最小值出现在T1,T5显著高于T1、T2、T3(P<0.05),但与T4处理差异不显著；T5处理下的Fo比T1、T2和T3处理分别高出26.23%、16.84%和13.05%。最大荧光值(Fm)随着氮磷配施浓度的增大,主要呈上升趋势,最大值出现在T4处理下,显著高于T1、T2处理(P<0.05),但与T3、T5的差异不显著；在T4处理下的Fm比T1、T2处理分别高出36.44%、16.93%。

图2 氮磷浓度梯度对小麦拔节期旗叶初始荧光(Fo)和最大荧光(Fm)的影响

2.3.2 对小麦旗叶Fv/Fm和PIabs的影响 Fv/Fm是最大光化学效率,指PSⅡ反应中心内原初光能转化效率[18-19]；Fv/Fm值越低说明植物受到的光抑制越强。由图3可以看出：随着氮磷配施浓度的增高,Fv/Fm呈先升高再降低的趋势,以T1处理下的Fv/Fm值最低,且与T2、T3、T4和T5处理存在显著差异(P<0.05)；以T3处理的Fv/Fm值最高,比T1高出7.00%。表明T3处理在小麦拔节期可以提高PSⅡ反应中心的光能转化效率和开放比例,提高光合作用的原初光能转换效率和电子传输活性,有利于叶片PSⅡ光反应的进行。

光化学性能指数(PIabs)是一个能够反映植物光合综合性能的参数,对逆境和胁迫反应更为灵敏[20-21]。由图3可见：PIabs的变化趋势与Fv/Fm一致,呈先升高再降低的趋势,以T3处理下的PIabs值最大,且显著高于T1、T4、T5(P<0.05)处理,分别高出45.56%、18.52%和31.48%；但T3处理的PIabs值与T2处理差异不大,说明T3处理下小麦的光合性能最强。

2.4 氮磷配施对小麦旗叶叶绿素荧光诱导曲线的影响

植物快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)可以反映出大量关于PSⅡ反应中心原初光化学反应的信息[22]。J相荧光强度升高是由于QB不能及时接受、还原来自QA-的电子,导致QA-的大量积累,I相和P相分别是由于快还原型PQ库和慢还原型PQ库被完全还原造成的[23]。从图4可以看出,在5种浓度梯度处理下的小麦拔节期叶片的OJIP曲线变化趋势基本相同,但荧光值有差异。在O点处(0.02 ms)T1、T5处理下的荧光值明显低于其他3个处理;从J点(2 ms)开始,不同氮磷配施下荧光值有所差异,以T3处理下为最高,分别高出T1、T2、T4、T5处理30.22%、15.35%、10.86%和19.37%;在I点(30 ms)时，不同处理间荧光值差异显著,T3的值分别显著高于T1、T2、T4和T5处理36.90%、17.36%、23.80%和21.79%;达到P点时，荧光值趋于稳定，不同处理的最大荧光值Fm表现为T3>T2>T5>T4>T1；在5个氮磷配施梯度处理间小麦拔节期叶片在I点和P点的荧光值差异显著。

图3 氮磷浓度梯度对小麦拔节期旗叶Fv/Fm及PIabs的影响

图4 不同处理小麦叶片的快速叶绿素荧光诱导动力曲线

2.5 氮磷配施对小麦旗叶PSⅡ供体侧、反应中心、受体侧的影响

Mo、Sm、ΦEo、ψo等参数主要反映PSⅡ受体侧的变化,PSⅡ受体侧包括QA、QB、PQ库等[17]。从表3中可以看出:在T1处理下Mo最高,说明QA所得到的电子用于自身还原的较多并且向下传递电子的能力最小,与T2、T3、T4、T5没有显著差异;Sm值随着氮磷浓度的增加以T4处理下最大,且与其他处理没有显著差异,说明T4处理下QA-被还原所需要的能量最大。ΦEo、ψo分别表示电子传递到电子传递链的QA-电子受体的量子产额和相对电子传递效率。由表3可以看出,T2处理下ΦEo最大，且与T3、T4没有显著差异,但与T1、T5具有显著差异;ψo在T2处理下数值最高,且与其他处理无显著差异；ΦEo和ψo均呈现先升高后降低的趋势,说明氮磷配施浓度对相对电子传递量子产额和电子传递效率产生了明显的影响。

PSⅡ反应中心吸收、捕获、电子传递及热耗散能量可以分别通过参数ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC和DIo/RC来表示[24]。ABS/RC表示单位反应中心吸收的光能。由表3可知,T1的ABS/RC值显著高于其他处理,说明在T1处理下光反应活性最高。随着氮磷配施浓度的增加，从T1到T5,TRo/RC值有先降低后升高的趋势,但处理间无显著差异。ETo/RC表示单位反应中心捕获的用于电子传递的能量。随氮磷配施浓度的增加，ETo/RC值有先升高再降低的趋势,以T2最大，但与其他处理差异不显著。DIo/RC表示单位反应中心耗散掉的能量,其值以T3下最低。

由F值可知，Mo、Sm、ψo、TRo/RC、ETo/RC在处理间没有显著差异；ΦEo和DIo/RC值在处理间有显著差异；ABS/RC值在处理间有极显著差异。

表3 氮磷配施对小麦旗叶Mo、Sm、ΦEo、ψo、ABS/RS、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC的影响

注:表中数据代表平均值±标准误；同列数据后字母不同代表差异性；“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

2.6 氮磷配施对小麦旗叶水分利用效率的影响

由图5知,氮磷配施下小麦旗叶水分利用效率在T3处理下最高,且显著高于T1、T2、T4和T5处理,分别高出38.27%、31.88%、19.97%和27.08%。

图5 氮磷配施对小麦旗叶水分利用效率的影响

2.7 氮磷配施下小麦生长、叶绿素含量、荧光参数和水分利用效率相关分析

由表4可以看出：水分利用效率与比叶面积存在极显著的正相关关系,与PIabs存在显著正相关关系；比叶面积与PIabs、总叶绿素含量呈显著正相关；相对含水量与PIabs和总叶绿素含量呈极显著正相关；PIabs与叶绿素总含量呈极显著正相关；DIo/RC与比叶面积、水分利用效率、叶片相对含水量、总叶绿素含量、PIabs均呈显著负相关。说明在5个处理中氮磷配施浓度以T3处理最适。

3 结论与讨论

本研究结果表明：叶片比叶面积(SLA)和叶片相对含水量(RWC)的变化趋势基本相同,均在T3处理下最高；其中T3处理下的比叶面积显著高于T1、T5。T3处理下的叶片相对含水量显著高于T1、T5。

T2、T3处理下小麦拔节期叶片叶绿素总含量显著高于其他处理的,说明T2和T3处理中的氮磷配施有利于促进叶绿素的合成。叶绿素a/b在5个处理间无显著差异,说明氮磷配施对捕光能力没有显著的影响。

Fo值(初始荧光)可以反映植物对光能的利用程度,Fo越低说明植物对光能的利用越高[25-26]。在本研究中，T5的初始荧光值最大,说明在T5处理下小麦叶片对光能的利用较低；而T1、T2和T3的Fo值较低,说明在这3个处理下小麦对光能的利用较高。Fm(最大荧光)可以说明电子反应程度的大小,Fm值越小,电子反应程度越小。最大荧光值(Fm)随着氮磷配施浓度的增大,主要呈上升趋势,最大值出现在T4处理下,显著高于T1、T2处理(P<0.05),但与T3、T5的差异不显著,说明在T3、T4、T5下小麦叶片的电子反应程度较大,电子较为活跃。综合Fo和Fm的分析可以看出T3处理是最适处理。

表4 不同氮磷配施下小麦生长、荧光参数和总叶绿素含量间的相关系数

注:“**”表示在0.01水平上显著相关；“*”表示在0.05水平上显著相关。

Fv/Fm值只在受到胁迫时才会下降[21],能够反映植物受氮磷浓度抑制时叶片受胁迫的程度,Fv/Fm值越大受胁迫程度越低。本研究发现,随着氮磷配施浓度的增加，Fv/Fm值先增加后降低,在T3处理下最大,说明在T3处理下小麦受到的抑制最弱。此外,T3的PIabs值最高,说明在T3处理下小麦叶片对光能的利用更强，T3处理在小麦拔节期可以提高PSⅡ反应中心的光能转化效率和开放比例,提高光合作用的原初光能转换效率和电子传输活性,有利于叶片PSⅡ光反应的进行[27-28]。

植物PSⅡ光合变化可以通过OJIP曲线来反映。本研究结果表明,在5种浓度梯度处理下的小麦拔节期叶片OJIP曲线变化趋势基本相同,但荧光值有差异。具体来说：从J点开始,不同处理下的荧光值有所差异,以T3处理下为最高;在I点时不同处理间荧光值差异显著,T3的值显著高于其他处理的;在J～I点之间，T3在QA-向QB的电子传递过程中所耗散的能量最小,且荧光值趋于稳定，最大荧光值Fm表现为T3>T2>T5>T4>T1；在5种氮磷配施梯度处理下小麦拔节期叶片在I点和P点的荧光值差异显著,可以明显从OJIP曲线中找出最适梯度为T3梯度。

在T1处理下小麦叶片的ABS/RC显著高于其他处理的,说明在T1处理下反应中心吸收的能量最高,光反应活性最高;从T1到T5,TRo/RC先降低后升高,但在不同处理间无显著差异,说明氮磷配施对反应中心捕获光能的数量没有显著影响。

ETo/RC表示单位反应中心捕获的用于电子传递的能量。在本研究中，随氮磷配施浓度的增加，ETo/RC值先升高再降低,以T2最大,但处理间差异不显著,说明氮磷配施对小麦的电子传递能力影响不显著。DIo/RC表示单位反应中心耗散掉的能量,以T3最低，且与其他处理具有显著差异。在T1处理下Mo最高，但与其他处理没有显著差异，说明5个处理对QA电子的传递没有产生显著影响。Sm值随着氮磷浓度的增加以T4处理最大,但与其他梯度处理没有显著差异,说明在T4处理下QA-被还原所需要的能量最大。ψo值在T2处理下最高,与其他处理无显著差异。在T2和T3处理下ΦEo较大，且与T1、T4、T5处理差异显著,表明在T2和T3处理下用于电子产额较高。在T4、T5处理下受体侧的电子传递体减少,PSⅡ供体侧的QA-累积,电子传递受阻。

相关分析结果表明：水分利用效率与比叶面积存在极显著的正相关关系,与PIabs存在显著正相关关系；比叶面积与PIabs、总叶绿素含量呈显著正相关；相对含水量与PIabs、总叶绿素含量呈极显著正相关；PIabs与叶绿素总含量呈极显著正相关；DIo/RC与比叶面积、水分利用效率、叶片相对含水量、总叶绿素含量、PIabs均呈显著负相关。说明在5个处理中以T3最适。

在T3处理的氮磷配施下，小麦生长、叶片叶绿素含量及叶绿素荧光特性最佳。因此可以推断随着氮磷浓度的增加,氮磷配施在90 kg/hm2(N90P90)的处理下“九麦2号”拔节期小麦长势最好。在N135P135、N180P180处理下拔节期小麦受到胁迫,其中在N180P180下受胁迫程度最大。在以后的试验中,还将补充更多的氮磷配施方案,以分析出最佳的氮磷配比。