基于活化铅笔芯电极的扑热息痛电化学传感器

郑 霄 陈苏靖 李芳芳 邓 娟 郑冬云*,2,3

(1.中南民族大学生物医学工程学院湖北武汉 430074;2.中南民族大学脑认知国家民委重点实验室湖北武汉 430074;3.医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室湖北武汉 430074)

扑热息痛亦称对乙酰氨基酚，它是一种常见的非抗炎解热镇痛药[1]，但过量服用该药会出现一些毒副作用[2]，因此对药品中扑热息痛含量的准确测定具有十分重要的生物医学意义。目前，常用于扑热息痛含量测定的主要有分光光度法、高效液相色谱法、红外光谱法、电化学发光法、酶催化光度法、电化学传感法等方法。其中，电化学传感法具有操作简单、成本低、线性范围宽、灵敏度高，响应时间短等特点，可实现对扑热息痛的在线实时动态检测[3]。

铅笔芯是由粘土和石墨按一定比例混合而制成的，它具有良好的导电性。铅笔芯电极即是以普通铅笔芯为基体材料制作而成，与其他固体电极相比，具有易于修饰、电位窗口宽、残余电流小、生物兼容性好等优点[4]。此外，与同为碳质电极的玻碳电极相比，铅笔芯电极与玻碳电极有相似的伏安响应，并且它的制备方法简单、价格低廉、比表面积大、重现性和稳定性较好[5，6]。因此，铅笔芯电极及化学修饰铅笔芯电极在电化学传感领域已得到广泛应用[7-9]。

本工作以2B铅笔芯为基体自制了裸铅笔芯电极，并将其置于0.1 mol/L KClO4和Na2CO3混合溶液中进行简单的循环伏安扫描，对电极表面进行活化，有效改善了电极的表面性能，提高了电极对扑热息痛的富集量及传感灵敏度。同时，对扑热息痛在活化铅笔芯电极上的电化学反应机理也进行了探讨。该扑热息痛电化学传感器具有制备简单、线性范围宽、灵敏度高、稳定性和重现性好等优点，并被成功应用于实际样品中扑热息痛含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器公司)；Sirion 200场发射扫描电子显微镜(FEI公司)；CL-200集热式恒温加热磁力搅拌器(金坛市予仪器有限责任公司)；pHS-3E酸度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。铅笔芯(直径为0.5 mm，2B，厂家：TOUCH LINE)和环氧树脂胶(AB胶)均购自超市；导电银胶购自深圳市鑫威新材料股份有限公司。

多巴胺(DA)、尿酸(UA)、抗坏血酸(AA)购自Fluka化学试剂公司；扑热息痛、无水乙醇、Na2CO3、KClO4、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl均购自国药集团化学试剂有限公司。实验所用的其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

扑热息痛缓释片(泰诺，本品每片含主要成分扑热息痛0.325 g)。

1.2 实验方法

1.2.1 裸铅笔芯电极的制备依据文献方法[10，11]制备裸铅笔芯电极。用导电银胶将铜丝与2 cm长的小段铅笔芯牢固粘接在一起，然后小心缓慢插入塑料枪头中。用AB胶将塑料枪头的两端进行密封，并将外露的铅笔芯长度裁剪至5 mm，即制得裸铅笔芯电极(Pencil Graphite Electrode,PGE)。使用之前将裸PGE置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]+1 mol/L KCl混合液中，在-0.2～+0.8 V电位范围内，以50 mV/s的速率进行循环伏安扫描，并确保所制备的裸PGE均具有几乎相同的电极面积，这是保证所制备的传感器具有良好重现性的重要前提。

1.2.2 活化铅笔芯电极的制备将裸PGE置于0.1 mol/L KClO4和Na2CO3混合溶液中，在-0.3～+2.0 V电位范围内，采用循环伏安法，以100 mV/s扫描速率环扫8圈，所制得的电化学活化铅笔芯电极(Electrochemically Activated Pencil Graphite Electrode,EAPGE)即为扑热息痛电化学传感器。

1.2.3 扑热息痛的电化学检测检测体系均采用三电极系统。其中，裸PGE或EAPGE为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。检测底液：0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0)，扫描电位范围：0～0.8 V，富集电位：0.2 V，富集时间：40 s。

2 结果与讨论

2.1 不同电极的表面形貌表征

为探究EAPGE对扑热息痛的电催化机理，对不同电极的表面形貌进行了扫描电子显微镜(SEM)表征，如图1所示。裸PGE的表面呈典型的石墨片层结构，表面比较光滑平整(图1A)；而在EAPGE表面，仅有小部分石墨片层结构依稀可见，而大部分都被侵蚀，呈碎片状，整个表面凹凸不平，较疏松多孔(图1B)。显然，相较于裸PGE，EAPGE具有较大的表面积，这有利于扑热息痛在电极表面的富集，从而有效提高扑热息痛电化学传感的灵敏度。

图1 裸PGE(A)和EAPGE(B)的扫描电镜(SEM)图Fig.1 SEM images of bare PGE(A) and EAPGE(B)

2.2 铅笔芯电极的电化学活化机制探讨

裸PGE的循环伏安扫描电化学活化过程如图2所示。在活化过程中，于1.55 V左右出现了一个氧化峰，对应于C的氧化。同时，第1圈的氧化峰峰形较好，峰电流较大，且伏安曲线平滑，说明电极表面比较光滑平整。在2～8圈的扫描过程中，伏安曲线锯齿状，噪音较大，峰电流较小，在实验过程中可观察到电极表面有气泡产生。说明电极表面正在被腐蚀而变得疏松，这与SEM表征结果一致。Allen等[12]的研究表明，在碳电极的电化学活化过程中，碳电极中的C可与底液中的O2反应生成CO2，而CO2溶于底液后又可以生成可溶性碳酸盐，而不管是CO2的产生还是可溶性碳酸盐的生成，均会对碳电极造成侵蚀，使其表面变得疏松，与待测底物的有效接触面积增大。

采用K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]对EAPGE的电化学性能进行了表征(图3)。相比于裸PGE，在EAPGE上 [Fe(CN)6]3-/4-的氧化与还原峰电流均增大，其氧化峰电位略微升高而还原峰电位略微降低。前者可能归因于EAPGE较大的比表面积，后者可能是由于EAPGE表面含有一些含氧基团[13，14]，如羟基、羧基、羰基等。这些基团均带有负电荷，会对[Fe(CN)6]3-/4-产生静电排斥作用。

图2 裸PGE在含有0.1 mol/L KClO4和Na2CO3溶液中的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammograms of bare PGE in 0.1 mol/L KClO4 and Na2CO3 solution Scan rate is 100 mV/s.

图3 裸PGE和EAPGE在含有1 mol/L KCl的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammograms of bare PGE and EAPGE in 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4- and 1 mol/L KCl solution Scan rate is 50 mV/s.

2.3 扑热息痛在不同电极上的电化学响应

图4 裸PGE(内插图)和EAPGE在含有2.0×10-5 mol/L(实线)和0 mol/L扑热息痛(虚线)的0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammograms of bare PGE(insert) and EAPGE in 0.1 mol/L PBS(pH=7.0) containing 2.0×10-5 mol/L(black solid line) and 0 mol/L paracetamol(gray dash line) Scan rate is 100 mV/s.

采用循环伏安法对2.0×10-5mol/L扑热息痛在裸PGE和EAPGE上的电化学响应进行了考察。扑热息痛的电化学反应是一个准可逆过程，且氧化峰峰形明显优于还原峰，因此选择氧化峰作为研究对象。其中，在裸PGE上可以看到一个比较小而钝的氧化峰，其峰电位Ep=0.422 V，峰电流Ip=2.201×10-6A(图4内插图)。在EAPGE上，当底液中不含扑热息痛时观察不到电化学响应(图4中虚线)，而当底液中含有2.0×10-5mol/L的扑热息痛时，可以看到一个比较大而尖锐的氧化峰，峰电位Ep=0.409 V，峰电流Ip=2.452×10-5A(图4中实线)。相比于裸PGE，扑热息痛在EAPGE上的电化学响应得到了明显改善，峰电位降低了13 mV，峰电流增大了22.32 μA，约为10倍。这说明EAPGE对扑热息痛的电化学氧化具有良好的催化作用，可用于扑热息痛的电化学传感。Chiavazza等[15]曾将玻碳电极在硼酸-磷酸盐缓冲溶液中进行电化学活化，并将活化电极应用于扑热息痛的电催化分析，其研究表明电化学活化后，碳电极表面会形成一个具有电活性的均质粘附层，该粘附层对含有苯环结构的小分子具有良好的电催化作用。此外，电化学活化后，碳电极的表面电阻显著降低，有利于加速电子传递。

2.4 扫描速率对扑热息痛电化学响应的影响

采用线性扫描伏安法，考察了不同扫描速率下扑热息痛在EAPGE上的电化学行为，结果如图5A所示。在25～325 mV/s的扫速范围内，扑热息痛的氧化峰和还原峰电流均随着扫速的增大而线性增加(图5B)，表明扑热息痛在EAPGE上的电化学反应是一个受吸附控制的过程[16]。同时，随着扫描速率的增加，扑热息痛的还原峰电位仅有稍许负移，与扫描速率成较差的线性关系；相反，氧化峰电位逐渐正移，且与扫描速率的自然对数呈良好的线性关系(图5C)，根据Laviron理论[17]，可计算出扑热息痛在EAPGE上的电子转移数：n=2.4≈2，与已有报道[18]一致。

图5 (A)不同扫描速率下(由内向外依次为：25,50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300,325 mV/s)5.0×10-5 mol/L扑热息痛在EAPGE上的循环伏安图;(B)扑热息痛氧化还原峰电流与扫速之间的线性关系图;(C)扑热息痛氧化还原峰电位与扫速自然对数之间的线性关系图Fig.5 (A)Cyclic voltammograms of 5.0×10-5 mol/L paracetamol on EAPGE at different scanning rates(from inner to outer the scan rate are 25,50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300 and 325 mV/s,separately);(B)The linear relationship between the oxidation reduction peak currents and scan rate;(C)The linear relationship between the oxidation reduction peak potentials and the common logarithm of scan rate

2.5 底液pH值对扑热息痛电化学响应的影响

图6 (A)不同pH值的0.1 mol/L PBS中5.0×10-5 mol/L扑热息痛在EAPGE上的循环伏安图；(B)扑热息痛氧化峰电流与底液pH值之间的关系；(C)扑热息痛氧化峰电位与底液pH值之间的线性关系Fig.6 (A)Cyclic voltammograms of 5.0×10-5 mol/L paracetamol on EAPGE in 0.1 mol/L PBS with different pH value;(B)The relationship between oxidation peak current and pH value;(C)The linear relationship between oxidation peak potential and pH valueScan rate is 100 mV/s.

采用循环伏安法，对底液pH值的影响进行了考察，结果如图6所示。底液pH值在4.0～9.0范围内逐渐升高时，扑热息痛的氧化峰电流逐渐增大，pH值为7.0时达到最大，随后逐渐减小(图6B)，故本实验选择7.0为检测底液的最佳pH值。同时，扑热息痛的氧化峰电位逐渐降低，且与底液pH值呈良好的线性关系(图6A和图6C)，说明扑热息痛在EAPGE上的电化学反应过程有质子参与。结合关系式：Ep=K-0.059(m/n)pH(式中K为常数，m为反应中转移的质子数，n为转移的电子数)可知，当扑热息痛在EAPGE上发生电化学反应时，转移质子数与电子数相同。综上所述，扑热息痛在EAPGE上的电化学反应是一个两质子两电子参与的准可逆过程。反应方程式推测如下：

2.6 电化学传感的线性范围和检出限

图7 (A)不同浓度扑热息痛在EAPGE上的方波伏安图。(B，C)扑热息痛氧化峰电流与其浓度之间的线性关系图Fig.7 (A)Square wave voltammograms of different concentrations of paracetamol on EAPGE;(B,C)The linear relationship between the oxidation peak currents of paracetamol and its concentrations

采用方波伏安法，考察了EAPGE用于扑热息痛电化学传感的线性范围和检出限，方波伏安法结果如图7所示。随着扑热息痛浓度的增大，其在EAPGE上的氧化峰电流逐渐增大，且在浓度3.0×10-6～1.0×10-5mol/L(7A)及1.0×10-5～1.0×10-4mol/L(7B)范围内，与其氧化峰电流呈良好线性关系，线性方程分别为：Ip(μA)=-2.93+2.16c(μmol/L),R2=0.99；Ip(μA)=13.05+1.08c(μmol/L),R2=0.99。当信噪比为3时，其检出限为9.0×10-7mol/L。

2.7 电化学传感的抗干扰能力、重现性和稳定性

对传感器的稳定性和重现性进行了考察。同一支EAPGE在空气中放置30 d后，其对20 μmol/L扑热息痛的电化学响应仍能保持初始信号的92%，表明传感器稳定性良好。用10支EAPGE平行检测20 μmol/L的扑热息痛，其相对标准偏差(RSD)为8.2%；用同一支EAPGE对20 μmol/L扑热息痛平行测定10次，其RSD为4.3%，说明传感器重现性良好。

2.8 实际样品分析

取扑热息痛缓释片5片(含扑热息痛0.325 g/tablet)，在研钵中研碎，然后加入无水乙醇，搅拌，使其充分溶解后过滤，用无水乙醇洗涤3～4次后，转入250 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，即得待测试液。在10 mL 0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中，用微量进样器加入5 μL试液，按2.6节方法进行测定，测定结果及回收率如表1所示。

表1 样品分析结果与回收率实验Table 1 Results of sample analysis and recovery experiment

3 结论

制备了电化学活化铅笔芯电极，其表面的均质粘附层以及疏松多孔的结构，使得该电极对扑热息痛的电化学反应具有良好的催化作用，同时电化学活化使电极表面携带了很多含氧基团，其与扑热息痛之间的氢键作用，对传感器良好的选择性起着关键的作用。该电化学传感器具有制备简单、线性范围宽、灵敏度高、稳定性和重现性好等优点，可用于实际样品中扑热息痛含量的测定。