基于ITS2鉴别黄草乌及其近缘种掺混

朱高倩， 周培军， 王丽， 李双良， 马莉， 符德欢

（1.云南省药物研究所，云南昆明 650111；2.云南白药集团创新研发中心，云南昆明 650111；3.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南昆明 650111）

黄草乌为毛茛科乌头属植物黄草乌（Aconitum vilmorinianumKomarov）的干燥块根，是西南地区传统乌头类药材之一，被收载于《云南省中药材标准》（2005 年版）、《重庆市中药饮片炮制规范》（2006年版）[1-2]。分布于云南中部和西部、四川（会理）及贵州西部[3-4]。该药材目前有栽培资源和野生资源，虽然有研究者对其栽培技术进行了长期摸索，并逐渐研发了规范化种植技术[5-7]，但其技术推广尚未完全普及，加之云南省境内乌头种类繁多[3]，导致市售药材市场中部分黄草乌药材可能存在掺混现象，而乌头属内不同物种化学成分种类、含量存在不同程度的差异[8-10]，掺混的黄草乌经过统一的炮制方法制黄草乌后，其有效成分（或有毒成分）含量均一性则难以保证，因此，黄草乌的掺混鉴别对确保制黄草乌入药相关成方制剂生产具有重要意义。

研究者已对黄草乌药材从种源、性状、显微、理化以及分子生物学方面进行了部分研究[11-12]，目前其显微鉴别被收录在《云南省中药材标准》（2005年版）中的【鉴别】项中[1]，但此方法在实际应用过程中有一定的局限性，尤其是在非完整性状的大批药材掺混鉴别方面很难进行应用。因此，有必要开发可应用于该药材掺混鉴别的技术手段。本研究根据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2015 年版四部）[13]“中药材DNA 条形码分子鉴定法指导原则”，以黄草乌及其近缘种为主要研究对象，开发黄草乌掺混鉴别技术，以期为药材产地、市售乌头类药材掺混鉴别提供技术支撑和理论基础。

1 材料与方法

1.1材料试验材料包括DNA条形码研究用试验材料和黄草乌掺混鉴别试验材料。黄草乌及其近缘物种ITS2 序列特征研究用材料包括16 个黄草乌居群、5 个长喙乌头居群、2 个马耳山乌头居群的叶片或干燥根茎，试验材料对应原植物标本均经中国科学院华南植物园杨亲二研究员及中国科学院昆明植物研究所李恒研究员鉴定，标本均存贮于云南省药物研究所标本室，其中，叶片经硅胶干燥保存。具体来源信息见表1。

表1 黄草乌及2个近缘种乌头的来源信息Table 1 Source information of A.vilmorinianum and its two related Aconitum species

黄草乌掺混鉴别样品即黄草乌与长喙乌头、马耳山乌头根茎生品进行不同比例的两两混合，具体见表2。

表2 不同比例黄草乌与其他2种乌头混合样品Table 2 The different proportions of A.vilmorinianum adulterated with its two related Aconitum species

1. 2试剂2 × 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（1.4 mol/L NaCl）提取缓冲液、2×Es Taq MasterMix（Dye），购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物，由北京博迈德基因技术有限公司合成；4S Green Plus 无毒核酸染料，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3仪器Mastercycler PCR 仪（德国Eppendorf 公司）；DYY-6C 电泳仪（北京六一仪器厂）；ZF-258全自动凝胶成像分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）。

1.4方法

1.4.1 DNA提取 采用改良CTAB[14]提取3种乌头叶片或根茎材料DNA。

1. 4. 2 PCR 扩增 采用引物ITS2F/ITS2R 对提取DNA 进行PCR 扩增。引物由华大基因合成，引物序列同《中国药典》（2015 年版四部）[13]，ITS2F：5’-GCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS2R：5’-G ACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。反应体系为50 μL，其中含双链DNA 模板2 μL，正反引物（浓度 为10 pmol/L）各0.2 μL， 2 × Es Taq PCR MasterMix（Dye）25 μL，ddH2O 22.6 μL。ITS2 位点的PCR 扩增条件： 94 ℃预变性4 min。进入循环：94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸40 s，30 个循环。72 ℃终延伸7 min。取PCR 产物5 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在ZF-258全自动凝胶成像分析系统下观察拍照。

1.4.3 PCR 产物序列测定及序列分析 PCR 扩增产物直接送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。用DNAMAN、Bioedit 软件进行序列比对，基因区段通过NCBIBLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行确定。MEGA 5.1 构建系统发育树。

表3 12个产地的黄草乌性状特征Table 3 The characteristics of A.vilmorinianum from 12 habitats

2 结果与分析

2.1不同产地黄草乌性状比较考察了其中12个产地的黄草乌药材性状，结果表明，不同产地的黄草乌药材性状差异较大，主要表现为根茎形状、长和直径，表面颜色，断面颜色等（见表3、图1）。根茎呈椭圆球形或胡萝卜形，有时末端稍弯曲，长35.72 ～141.30 mm，直径6.40 ～20.53 mm。表面呈褐色、黄褐色、灰褐色、深褐色、棕色或深棕色不等，具多数褶皱或纵沟纹。质坚硬，能折断，断面淡黄色、灰白色、灰黄色或灰褐色，粉性。

图1 黄草乌性状特征Figure 1 The characteristics of A.vilmorinianum

2.2黄草乌及其2个近缘种的ITS2序列比较采用引物ITS2F/ITS2R对黄草乌及其近缘种共计88个样品提取的DNA 进行PCR 扩增。结果显示，黄草乌、长喙乌头、马耳山乌头的ITS2 片段长度均为208 bp，三者的种内K2P 遗传距离分别为0.000 ～0.010、0.000 ～0.010、0.000 ～0.019；黄草乌与长喙乌头的种间K2P 遗传距离为0.005～0.019，明显大于各自的种内K2P 遗传距离；黄草乌与马耳山乌头的种间K2P遗传距离为0.010 ～0.029，大于等于黄草乌种内K2P 遗传距离，但不大于马耳山乌头种内K2P 遗传距离（见表4）。从序列比对结果看，16 个产地黄草乌的ITS2 片段长度为208 bp，在第113 bp、第185 bp、第191 bp 处分别有G/T、A/C、G/A 变异；长喙乌头和马耳山乌头的ITS2 长度也为208 bp，其中在第93 bp、第157 bp、第196 bp处为长喙乌头的种内变异，在第57 bp、第62 bp、第76 bp、第141 bp、第182～183 bp处为马耳山乌头的种内变异。16个产地黄草乌在ITS2位点的第169 bp、第201 bp 处为C、C，长喙乌头为T、C，马耳山乌头为C、T，通过这两个位点可将黄草乌与长喙乌头、马耳山乌头进行鉴别（见表5）。

表4 黄草乌及其2个近缘种ITS2序列的遗传距离Table 4 Genetic distance of A.vilmorinianum and its two related Aconitum species in ITS2 sequence

表5 不同产地黄草乌及其近缘种居群ITS2差异位点表Table 5 Difference in ITS2 locus of A.vilmorinianum from different habitats and its two related Aconitum species

（续表5）

2.3黄草乌及其2个近缘种的系统发育分析以黄草乌及其2 个近缘种的序列比对结果构建NJ 树（见图2），可见马耳山乌头单独聚为1 个大支，黄草乌和长喙乌头在1 个大支上。而16 个产地黄草乌又聚为1个亚支（下分为3个小支），长喙乌头为另1个亚支。说明ITS2位点上，黄草乌与长喙乌头遗传距离较近，而与马耳山乌头较远。ITS2 位点可将黄草乌与长喙乌头、马耳山乌头完全鉴别开。

2.4不同比例黄草乌及其种混合样品ITS2峰值图特征黄草乌与长喙乌头、马耳山乌头粉末混合样品的ITS2序列峰值图（见图3）表明，在ITS2的第169 bp处，当黄草乌与长喙乌头粉末混合比例为1∶1或1∶2 时，“T”碱基峰值高于“C”碱基峰值，呈现长喙乌头纯样品相似峰值。而当黄草乌与长喙乌头比例为2∶1 时，则显示“T”碱基峰值高于“C”碱基峰值，呈现黄草乌纯样品相似峰值。在ITS2 的第201 bp 处，黄草乌与马耳山乌头粉末混合比例为1∶1 或1∶2 时，“T”碱基峰值均高于“C”碱基峰值，呈现马耳山乌头纯样品相似峰值，比例为2∶1 时，“C”碱基峰值则高于“T”碱基峰值，呈现黄草乌纯样品相似峰值。

图2 不同产地黄草乌及其近缘种ITS2位点系统发育树Figure 2 The phylogenetic tree for ITS2 locus of A.vilmorinianum from different habitats and its two related Aconitum species

3 讨论

3.1栽培黄草乌性状差异大难以稳定鉴别随着黄草乌栽培技术的发展[5-7]，云南省很多区域都进行了黄草乌的规模化栽培，但其种源、种苗质量目前暂未完全形成标准规范，导致不同地域种植的黄草乌药材质量存在一定差别。在药材市场上，黄草乌以其根茎进行交易。云南省境内乌头种类繁多[3]，其混淆药材来源为野生资源或栽培资源。《云南植物志》记载黄草乌为缠绕藤本植物，块根为椭圆形或胡萝卜形，与其相似的物种不在少数[3]。在云南境内长喙乌头也具有一定规模的栽培资源，其内含有2005 年版、2010 年版《中国药典（二部）》收载的草乌甲素[13]，是草乌甲素提取的潜在植物资源，其块根与黄草乌相似，为胡萝卜形[3]，此类掺混有时给药材收购造成很大困难。本研究中16 批黄草乌根茎长、直径、表皮颜色等特征均表现为有较大差异，尤其是其大小普遍比《云南植物志》[3]所述的“长2.5 ～7 厘米，粗1 厘米”更大、更粗壮，其原因可能与产地的环境、栽培方式、施肥力度等[15-18]有关，难以作为稳定的鉴别指标。

图3 不同比例黄草乌及其近缘种掺伪的ITS2峰值图特征Figure 3 ITS2 peak value characters in the adulteration of A.vilmorinianum with different proportions of its two related Aconitum species

3.2基于ITS2鉴别黄草乌掺混具有一定可行性目前对乌头属的分子鉴别多集中于系统发育分析[15-16]，其针对某个种的样本量较为局限，对于栽培乌头药材的鉴别有一定的参考价值。而对于ITS位点在乌头属的鉴别，有研究者对川乌、草乌、紫乌头、黄草乌、滇南草乌等都进行过ITS位点的研究[12，17-20]，其相互间的对比鉴别多局限于个别中有限个体之间进行比较，尚需完善乌头栽培资源的来源范围。本研究基于既往研究基础上，采用ITS2 序列可用于鉴别黄草乌、长喙乌头和马耳山乌头居群，结果与既往研究结果相似，ITS2对于3种乌头的鉴别效果较为明显；而16 个产地的黄草乌ITS2 还表现为较为保守序列，说明稳定性相较于多变且受外部环境影响的性状，ITS2 更适用于黄草乌药材的鉴别。在此基础上，本研究对黄草乌与长喙乌头、马耳山乌头的混合粉末样品也进行了探究，结果表明ITS2 位点对于长喙乌头或马耳山乌头掺伪样品中黄草乌占比为1/2、1/3时可检测出掺伪，当黄草乌占比为2/3 时则检测不出掺伪。此结果与前人利用ITS鉴定不同比例的人参和西洋参效果相似[21]，即当掺伪物在混合物中占比较大时如本研究中伪品占一半以上，此法有效；相反，正品在混合物中占较大时，此法容易失效。

本研究目前虽然用ITS2 可鉴别黄草乌与长喙乌头、马耳山乌头，但鉴于乌头属种类繁多[2]，药材市场上充斥着的乌头属混淆药材远不止已研究的物种，ITS2 对黄草乌的鉴别可能还存在有局限性。在未来工作中还可结合其他位点如在人参属利用ITS、18S和matK的多重位点特异性PCR法鉴别人参、三七、西洋参掺杂[22]，也可用其他类型的DNA 分子标记，如用EST-SSR、EST-SNP 标记结合高分辨率熔解曲线和焦磷酸测序分析技术鉴别金银花掺伪情况[23]，或是参考其他学科领域的技术如FTIR 多级图谱鉴别山茱萸掺伪[24]等相关技术对黄草乌进行系统鉴别，以期不断确保黄草乌基原正确、药材质量均一，从而达到安全用药的目的。