全细胞催化生产γ氨基丁酸转化液脱色工艺研究

高敏 柯崇榕 高萍 刘孟粟 黄建忠

摘 要：針对本实验室1株高产γ氨基丁酸（γ aminobutyric acid，简称GABA）的大肠杆菌，以麸酸为底物利用全细胞催化的方法生产GABA，研究了生产GABA的转化液脱色工艺。试验采用活性炭结合树脂层析的脱色方法，首先对14种脱色树脂的脱色能力进行筛选，结果表明FPA53阴离子交换树脂的脱色效果显著优于其他树脂，通过单因素试验对树脂的脱色温度、pH进行优化，得到FPA53树脂的理想脱色条件与转化液初始条件相近，为温度40℃、pH6。在该条件下，转化液的脱色率达到了85.1%，GABA回收率达到98%以上，谷氨酸去除率达到23%以上。对6种活性炭进行筛选，结果表明2号竹清活性炭的脱色效果显著优于其他活性炭，通过单因素试验对活性炭的添加比例进行优化，得到1%的活性炭添加比例为试验理想比例，在此条件下，转化液的脱色率达到92.8%以上，GABA回收率达到99%，而液体损失率只有2%。最后，将筛选得到的活性炭与脱色树脂结合使用，结果显示，结合使用后的转化液脱色率可以达到99.5%以上，GABA回收率达到98%以上，结晶颗粒洁白无杂色。该研究结果为GABA精制及其大规模工业生产提供基础。

关键词：γ氨基丁酸;脱色;树脂;活性炭;纯化

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）01-0017-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.01.004

Decoloring Technology of the Conversion Solution for Producing γ aminobutyric Acid by Whole cell Catalysis

GAO Min1，2， KE Chong rong1，2， GAO Ping1，2， LIU Meng su1，2， HUANG Jian zhong1，2*

（1. College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350007， China; 2. Engineering Research Center

of Ministry for Industrial Microbiology， National and Local Joint Engineering Research Center for Industrial Microbial

Fermentation Technology， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350007， China）

Abstract： Aiming at a strain of colibacillus with high yielding γ aminobutyric acid （GABA） in our laboratory， the whole cell catalysis method was used to produce GABA with glutamic acid as the substrate， and the decolorization process of the conversion solution for the production of GABA was studied. In the experiment， the decolorization method of active carbon combined with resin chromatography was used. Firstly， the decolorization ability of 14 kinds of decolorizing resins was screened. The results showed that the decolorization effect of FPA53 anion exchange resin was significantly better than that of other resins. Through the single factor test， the decolorization temperature and pH of the resin were optimized， and the ideal decolorization condition of FPA53 resin was similar to the initial condition of the conversion solution， with a temperature of 40℃ and a pH of 6. Under these conditions， the decolorization rate of the conversion liquid reached over 85.1%， the recovery rate of GABA reached over 98%， and the removal rate of glutamic acid reached over 23%. The six kinds of activated carbons were screened， and the results showed that the decolorization effect of No.2 Zhuqing activated carbon was significantly better than that of other activated carbons. The appending proportion of activated carbon was optimized through the single factor experiment， and the appending proportion of 1% activated carbon was the ideal proportion of the test. Under these conditions， the decolorization rate of the conversion solution reached over 92.8%， the recovery rate of GABA reached 99%， and the liquid loss ratio was only 2%. Finally， the selected activated carbon was combined with the decolorizing resin， and the results showed that the decolorization rate of the conversion solution after the combined use could reach over 99.5%， the recovery rate of GABA could reach over 98%， and the crystalline particles were white and no variedness. The results of this study provided a basis for GABA refining and its large scale industrial production.

Key words： γ aminobutyric acid; Decolorization; Resin; Ativated carbon; Purification

γ氨基丁酸（γ aminobutyric acid，简称GABA），广泛存在于自然界中，是动植物体中重要的非蛋白质氨基酸，具有降血压[1]、镇定安神[2]、治疗癫痫[3]等多种生理功能[4-7]，因此，被广泛应用于食品、饲料、医疗等领域。当前，GABA的生产方法以微生物发酵法为主[8-9]，微生物法又分为直接发酵法[10-11]和全细胞催化法[12]，与直接发酵法相比，全细胞催化法具有杂质含量少，产物分离纯化简单，菌体可重复利用等优点[13-15]。全细胞催化法生产GABA的底物常使用麸酸，麸酸是一种未精制的谷氨酸，具有杂质较高，色素含量重的特点，但是价格低廉，是一种常用的工业生产原料[16-18]。

使用大量麸酸为底物全细胞催化生产GABA，转化液的主要杂质是未转化完全的谷氨酸和转化过程产生的色素（底物、微生物次级代谢物、设备引入、加酸加碱等单元操作）[19-21]，谷氨酸可以通过提高麸酸的转化率来降低[22]，但是对色素的去除并不十分有效，因此色素的去除是精制GABA的关键。目前工业上对GABA的脱色方法主要集中在活性炭脱色[23-25]与树脂脱色[26-28]两种方法上。其中，活性炭是工业上常用的一种脱色剂，具有吸附范围广、价格低廉等优点，但是通常具有回收率低、再生困难等缺点。树脂脱色具有选择性好、可再生等优点，但是吸附面小。目前工业上使用的脱色方法通常是采用两种脱色方式中的一种，而对活性炭与脱色树脂结合使用的报道较少。使用单一脱色方式脱色率一般低于95%[29-30]，GABA回收率较低，造成结晶的GABA晶体色泽较深，纯度较低。因此，本研究在中试基础上分别对脱色树脂与活性炭进行筛选，拟建立一种高效的活性炭结合树脂层析的GABA脱色方式，为GABA进一步工业化扩大生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GABA转化液由本实验室自制提供，浓度约290 g·L-1;GABA标样购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;异硫氰酸苯酯、三乙胺购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙酸钠、冰醋酸购自西陇化工股份有限公司;LS100、LS305、LS106、LS200、LS300B等树脂购自陕西蓝深特种树脂有限公司;CAD40、AB8树脂购自安徽三星树脂科技有限公司;Amberlite XAD18、Amberlite XAD 16N、Amberlite XAD 1600、FPA40CL、FPA53树脂购自上海安澜德生物科技有限公司;SD300树脂购自江苏色可赛思树脂有限公司;DM301树脂购自北京寰宇科创生物科技发展有限公司;1～6号活性炭分别来自江苏竹溪活性炭有限公司、巩义市北山口竹清活性炭厂、江苏康宏炭业有限公司、河南郑州竹林活性炭开发公司、湖南力远活性炭有限公司以及本实验室留存的活性炭，均为木质粉末活性炭，粒度为200目（6号活性炭为粉末活性炭，但活性炭类型与粒度未知）;其余试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

Waters E2695高效液相色谱仪、waters 2998 PDA检测器，购自沃特世科技（上海）有限公司;島津UV1800紫外可见分光光度计，购自岛津（上海）实验器材有限公司;贝克曼J26高速冷冻离心机，购自美国贝克曼库尔特有限公司;其余仪器（50 L发酵罐、真空浓缩仪等）均来自本实验室中试车间。

1.3 试验方法

1.3.1 色素浓度分析波长的确定 对GABA转化液进行全光谱扫描（190～800 nm），扫描结果显示转化液无特征吸收波长。针对这种情况，当前的主要解决方法是对待测液进行梯度稀释，然后考察不同浓度的待测液在360～480 nm波长中的线性关系，找出线性最佳的波长作为检测波长[28，31-32]。因此，将待测转化液分别稀释为原浓度的50%、25%、12.5%、6.25、3.125%，然后分别在360、400、440、480 nm处检测其吸光值，找出线性最佳的波长。

1.3.2 脱色树脂的筛选 分别取14种预处理过后的脱色树脂（表1）[33]，抽滤至无明显液体流出，然后称取5 g抽滤后的树脂放入烘箱烘至恒重，计算湿树脂含水量。称取相当于1 g干树脂的湿树脂于250 mL三角瓶中，加入50 mL转化液，于40℃、220 r·min-1的摇床中振荡吸附2 h，然后分别计算脱色率、GABA回收率和谷氨酸去除率。

1.3.3 FPA53脱色树脂脱色条件的优化

1.3.3.1 温度对树脂脱色的影响 称取相当于1 g干树脂的FPA53湿树脂于250 mL三角瓶中，加入50 mL转化液，然后分别放入20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的摇床中振荡吸附2 h，最后计算不同温度条件下FPA53树脂的脱色率与GABA回收率。

1.3.3.2 pH对树脂脱色的影响 称取相当于1 g干树脂的FPA53湿树脂于250 mL三角瓶中，加入50 mL转化液，分别用HCL或NAOH将转化液pH调整到2、3、4、5、6、7、8、9，然后和对照组转化液原液（pH 6.36）一起置于40℃摇床中振荡吸附2 h，最后计算不同pH条件下FPA53树脂的脱色率、GABA回收率与谷氨酸去除率。

1.3.4 活性炭筛选 取50 mL转化液加入到250 mL三角瓶中，按2%的终浓度分别加入6种不同型号的活性炭（W/V），分别标为1号、2号、3号、4号、5号、6号，40℃ 220

r·min-1吸附2 h，然后12000 r·min-1离心10 min去除活性炭，上清用0.22 um滤膜过滤去除残留活性炭，计算脱色率。

1.3.5 活性炭比例的确定 取50 mL转化液加入到250 mL三角瓶中，分别按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的终浓度加入2号活性炭，40℃ 220 r·min-1吸附2 h，吸附后12000 r·min-1离心10 min，计算液体损失率。另取上清用0.22 um滤膜过滤去除残留活性炭，然后计算脱色率、GABA回收率。

1.3.6 活性炭结合树脂层析 取50 mL转化液加入到250 mL三角瓶中，分别按1%活性炭、2%活性炭、FPA53树脂层析、1%活性炭结合树脂层析、1%活性炭连用2次、树脂层析连用2次的脱色方法对转化液进行处理，转化条件按照1.3.2与1.3.4进行，最后计算不同处理的脱色率、GABA回收率与谷氨酸去除率。

1.3.7 活性炭结合树脂层析中试试验结果 按1%的比例（W/V）将2号活性炭添加到转化液中吸附2 h，然后离心去除活性炭与固形物，将上清以4 BV·h-1的流速通过层析柱，每隔15 min测量流出液的吸光值，计算脱色率，调整上样流速，保持流出液的脱色率在99%以上。收集流出液进行结晶罐浓缩结晶，烘箱干燥后制得GABA样品。

1.4 分析方法

谷氨酸浓度与GABA浓度采用PITC柱前衍生法进行测定。具体方法为：将衍生剂A（1.2%异硫氰酸苯酯的乙腈溶液）、衍生剂B（13.9%三乙胺的乙腈溶液）与样品（标品）按1∶1∶2的体积比混匀，30℃避光衍生1 h，衍生结束后加入与衍生体系等量的正己烷终止反应，分层后吸取下层液体过滤至液相瓶中。配制好流动相A（乙酸钠50 mmol·L-1，乙酸调至pH 7.0）、流动相B（100%乙腈）;采用C18反向色谱柱（waters sunfire C18 4.6×250 m），设置柱温40℃，设置时间程序（0～12 min 乙腈10%～40%，12～16 min 乙腈40%，16～20乙腈10%）进行梯度洗脱。

脱色率采用比色法进行测定。

1.5 数据处理方法

试验数据采用SPSS统计软件进行单因素方差分析，显著性水平取α=0.05，不同水平间用小写字母表示。脱色率、GABA回收率、谷氨酸残留率、谷氨酸去除率、液体损失率计算公式如下：

脱色率（%）=（脱色前吸光值-脱色后吸光值）/脫色前吸光值×100

GABA回收率（%）=GABA脱色后的浓度/GABA脱色前的浓度×100

谷氨酸残留率（%）=脱色后谷氨酸浓度/脱色前谷氨酸浓度×100

谷氨酸去除率（%）=（脱色前谷氨酸浓度-脱色后谷氨酸浓度）/脱色前谷氨酸浓度×100

液体损失率（%）=（离心前的液体体积-离心后的上清液体体积）/离心前的液体体积×100

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

如图1，GABA转化液在OD440具有最佳的线性关系，能较好表征样品色素浓度变化情况，因此选用OD440作为检测波长。

2.2 树脂筛选

本试验考察了多种树脂对GABA转化液色素的吸附效果，结果如表1。如表1所示，各脱色树脂的脱色效果具有显著差异，其中FPA53阴离子脱色树脂在各类树脂中具有最佳的脱色率、GABA回收率与谷氨酸去除率。GABA转化液中含有大量的大分子色素[20， 34]，通常吸附这类色素时需要较大的粒径。从表1结果可知，粒径大的树脂其脱色率显著高于粒径小的树脂，FPA53树脂的粒径在各类树脂中较大，这是FPA53树脂脱色能力较好的一个重要因素。同时，在GABA转化液中的色素通常具有一定的带电性[34]，选用离子交换树脂在适宜的pH下能大量吸附此类色素，FPA53树脂属于离子交换树脂是其有较好脱色率的另一个重要原因。

2.3 脱色树脂脱色条件的优化

2.3.1 温度对树脂脱色的影响 试验考察了FPA53树脂在不同温度下的吸附效率，结果如图2。

从图2可知，温度对于GABA回收率的影响差异不显著。较高的温度有利于FPA53树脂对色素的吸附，但树脂在40℃～60℃脱色率随温度变化差异不显著，考虑到进行全细胞催化时的温度为45℃，因此，转化结束后可直接用于脱色而不需要额外调节脱色温度。

2.3.2 pH对树脂脱色的影响 试验考察了不同pH对FPA53树脂脱色效果的影响，结果如图3。

如图3所示，FPA53树脂的脱色率、GABA回收率、谷氨酸去除率在不同pH间具有显著差异。树脂的脱色能力在较高pH时显著优于较低时的pH，但同时高pH会降低GABA回收率。同时，当脱色pH过低或过高时（pH<3，pH>7）树脂的谷氨酸去除率显著下降。其原因可能是FPA53树脂属于阴离子交换树脂，当pH<3时，对谷氨酸（等电点3.2）不吸附;当pH>7，其对色素吸附亲和力更强。综合分析，选择不调节pH，直接选用初始pH 6.36。

2.4 活性炭筛选

本试验考察了不同厂家的活性炭对GABA转化液的脱色效果的影响，结果如图4。如图4所示，不同活性炭脱色效果存在显著差异，其中2号竹清活性炭的脱色效果显著好于其他活性炭。

2.5 活性炭比例的确定

本试验对不同终溶度的2号活性炭的脱色能力进行考察，结果如图5。

如图5所示，不同比例的2号活性炭在脱色率、GABA回收率、谷氨酸去除率存在显著差异。随着2号活性炭比例的增加，脱色率也随之提高，当添加比例达到1%时，脱色率已达90%以上，当活性炭比例>2%时，脱色率开始增加不显著。同时，GABA回收率随着活性炭比例的增大而减小，虽然上清中GABA损失率都较低，但是由于活性炭的吸水性，转化液的损失较大，当活性炭比例>2%时其液体损失率约为10%，相比而下1%时液体损失率只有2%。综合分析选用1%的活性炭进行下一步试验。

2.6 活性炭结合树脂层析试验

本试验比较了1%活性炭、2%活性炭、FPA53树脂层析、1%活性炭结合树脂层析、1%活性炭连用2次、树脂层析连用2次等脱色方法效果，结果如图6所示。

从图 6可知，采用1%活性炭与树脂层析相结合的方法脱色效果显著好于其他脱色方式，且GABA回收率与谷氨酸去除能力也较好。当连续活性炭脱色时，脱色率增加不显著，但GABA的回收率却出现下降现象，其原因可能是该类型活性炭对残留色素的吸附较为微弱。与活性炭类似，当连续使用树脂层析时，虽然更有助于对谷氨酸的吸附，但其脱色率却增加不显著。因此，将活性炭与脱色树脂层析相结合，能充分结合两种脱色方式的优势，增强脱色效果，是一种十分有效的脱色方式。

2.7 脱色试验结果

试验考察了活性炭结合树脂脱色工艺的脱色效果，结果如图7～8。

从图7～8可知，经过活性炭结合树脂层析的脱色工艺后，GABA转化液在浓缩前后均呈一种透明澄清的溶液状态，结晶后颗粒洁白、无杂色，说明转化液脱色已较为彻底。试验结果表明活性炭结合树脂层析的脱色工艺可行，可用于中试之后的扩大生产。

3 结论

采用活性炭结合树脂层析的工艺对GABA转化液进行脱色处理。从14种脱色树脂中以脱色率、GABA回收率、谷氨酸去除率为指标进行筛选，结果显示，FPA53离子交换树脂的脱色率达到85.1%、GABA回收率达到98%以上，谷氨酸去除率达到23%以上，其性能显著优于其他脱色树脂，在对其脱色条件进行优化时，发现其脱色能力在40～60℃差异不显著，因此选择以转化温度45℃直接上样，无需调节温度。在研究其脱色pH时发现较高的pH（pH>7）有助于增加脱色率，但同时也会增加GABA的损失率，因此选择脱色时不调节转化液pH，直接原液上样，简化了脱色工艺。随后研究了不同活性炭对GABA的脱色能力，结果显示2号竹清活性炭脱色率显著优于其他活性炭，2%添加量脱色率达到96%以上，在综合了脱色率、GABA回收率、液体损失率后，选择1%的活性炭添加比例，在此条件下脱色率达到92%以上，且GABA回收率达到99%，液体损失率降为2%。最后，将筛选得到的活性炭与脱色树脂进行结合，最终脱色率达到99.5%，GABA回收率达到98%以上，谷氨酸去除率达到12%以上，结晶后晶体洁白、无杂色。研究表明，該脱色工艺设计合理，操作简便，脱色率和GABA回收率高，能为中试以后的扩大生产提供一个可靠的参考依据。

参考文献：

[1]KAZUHITO，H，K MASAYUKI，K KEIKO，et al.Effect of a gamma aminobutyric acid enriched dairy product on the blood pressure of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar Kyoto rats[J].British Journal of Nutrition，2004，92（3）：411-417.

[2]KALUEFF A V，NUTT D J.Depression，and Anxiety，Role of GABA in anxiety and depression[J].Depression and anxiety，2004，24（7）：495-517.

[3] OKADA T，SUGISHITA T，MURAKAMI T，et al.Effect of the defatted rice germ enriched with GABA for sleeplessness，depression，autonomic disorder by oral administration[J].Nippon Shokuhin Kaaku Kogaku Kaishi，2000，47（8）：596-603.

[4] ALAN W B，BARRY J S.The Metabolism and Functions of γ Aminobutyric Acid[J].Plant Physiology，1997，115（1）：1-5.

[5] DIANA M，QUILEZ J，RAFECAS M.Gamma aminobutyric acid as a bioactive compound in foods：a review[J].Journal of Functional Foods，2014，10：407-420.

[6] LI C，ZHAO Q Y，MA Y P，et al.Effect of γ aminobutyric acid on growth performance and blood parameters in broilers under heat stress formed by the intense heat conditions[J].Chinese Journal of Veterinary Science， 2010.

[7]杨胜远， 陆兆新，吕风霞，等.γ氨基丁酸的生理功能和研究开发进展[J].食品科学，2005，26（9）：546-551.

[8] 林亲录，王婧，陈海军.γ氨基丁酸的研究进展[J].现代食品科技，2008，24（5）：496-500.

[9] 梁恒宇，邓立康，林海龙，等.新资源食品：γ氨基丁酸（GABA）的研究进展[J].食品研究与开发，2013，34（15）：119-123.

[10] DIKSHIT R，TALLAPRAGADA P.Screening and optimization of γ aminobutyric acid production from Monascus sanguineus under solid state fermentation[J].Frontiers in Life Science，2015，8（2）：172-181.

[11]YANG H，XING R，HU L，et al.Accumulation of γ aminobutyric acid by Enterococcus avium 9184 in scallop solution in a two stage fermentation strategy[J].Microbial Biotechnology，2016，9（4）：478-485.

[12] 杨帆.微生物转化法产γ氨基丁酸[D].无锡：江南大学，2008.

[13]王期.生物转化法应用重组谷氨酸脱羧酶合成γ氨基丁酸[D].南京：南京师范大学，2011.

[14]李文强，刘洋，唐荣兴，等.全细胞生物转化法制备γ氨基丁酸[J].湖北大学学报（自然科学版），2019，41（1）：5-9.

[15]ZHAO W R，HUANG J，PENG C L，et al.Permeabilizing Escherichia coli for whole cell biocatalyst with enhanced biotransformation ability from l glutamate to GABA[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2014，107（9）：39-46.

[16]王兰刚，王宝良，赵起.提高谷氨酸质量的几点措施[J].发酵科技通讯，2010，39（1）：30-31.

[17]韦亚锋，汪洪湖，江立新，等.一种从L麩酸精制母液中分离L谷氨酸和L焦谷氨酸的方法[P].中国专利：201410340233.6，2014-12-03.

[18]佚名.我国味精生产现状[J].标准化信息，1994（5）：33.

[19]高爱同.高产γ 氨基丁酸乳酸菌发酵条件优化及分离纯化工艺研究[D].金华：浙江师范大学，2013.

[20]BIRCH G G， PARKER K J. Sugar：science and technology[M].London：Applied Science Publishers Ltd.， 1979.

[21]黄国伟.食品化学与分析[M].哈尔滨：哈尔滨工程大学出版社，2014.

[22]赵伟睿.微生物细胞催化合成γ氨基丁酸效能强化的研究[D].浙江：浙江大学，2015.

[23]马强.γ氨基丁酸结晶工艺研究[D].无锡：江南大学，2009.

[24]吴巧玉，谢祥聪，高爱同，等.短乳杆菌发酵液中γ氨基丁酸的脱色和纯化工艺探讨[J].发酵科技通讯，2015，44（3）：12-17.

[25]张术聪，刘婷婷，杨套伟，等.从植物乳杆菌全细胞转化液中分离纯化γ氨基丁酸的工艺研究[J].食品与发酵工业，2010（11）：1-5.

[26]GAO Q，DUAN Q，WANG D P，et al.Separation and Purification of gamma Aminobutyric Acid from Fermentation Broth by Flocculation and Chromatographic Methodologies[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（8）：1914-1919.

[27]嵇豪，蒋冬花，周琴，等.D001阳离子交换树脂分离红曲霉发酵液中γ氨基丁酸的研究[J].中国粮油学报，2011，26（08）：95-99.

[28]王兢.高纯度γ氨基丁酸的制备及脱色工艺研究[D].无锡：江南大学，2006.

[29]李向平.发酵液中γ氨基丁酸提取工艺的研究[D].浙江：浙江大学，2006.

[30]郎丽，蒋丽华，邱勇隽，等.γ氨基丁酸的色谱分离[J].过程工程学报，2016，16（3）：418-423.

[31]王兢.高纯度γ氨基丁酸的制备及脱色工艺研究[D].无锡：江南大学，2006.

[32]黄俊，梅乐和，胡升，等.γ氨基丁酸发酵液的絮凝和脱色工艺研究[J].食品工业科技，2009，30（7）：257-259，269.

[33]顾觉奋.离子交换与吸附树脂在制药工业上的应用[M].北京：中国医药科技出版社，2008.

[34]谢笔钧.食品化学[M].第3版.北京：科学出版社，2003.

（责任编辑：柯文辉）