不同激素配比对梅花花粉离体萌发的影响

焦雪辉，史喜兵，周小娟，孙毅宁，申潇潇

（郑州市农林科学研究所，河南郑州450005）

梅花（Prunus mume）是我国十大传统名花之一，自古以来深受人们喜爱。其品种资源丰富，色、香、形、韵各具特色，观赏价值极高，尤其开花时节在冬季，为萧索的冬季增添了一道独特的景观。梅花在我国有超过3 000 a 的引种栽培历史，在这期间人们不断地探索研究，许多新品种被培育出来，在增加种质资源的同时，也使我国的园林景观得到了极大的丰富[1-2]。

梅花优良品种选育一直以来是研究人员的一项重要工作，其中，花粉活力测定是进行品种选育的必要步骤，对指导梅花育种具有重要的理论和现实意义[3]。在亲本选择中，除了要考虑父本的观赏性状和抗性等因素外，选择花粉活力高、花粉量多的品种作父本对杂交成功至关重要[4]。花粉活力测定方法很多，其中，离体萌发测定法因其测定结果最接近原始结果而受到广泛应用。离体萌发法一般分为固体培养和液体培养。其中，液体培养操作具有简单、迅速、合理，并可完全定量的优点[5]，在试验中应用较多。选择培养基时，要根据不同植物种类进行选择，必要时还需要对基本培养基进行改良，增加Ca2+、K+、PEG、糖等可以促进花粉萌发的元素或物质等[6-7]。赵宏波等[3]通过试验发现，PEG 4000 能显著促进梅花花粉萌发，低质量浓度（50 g/L）蔗糖对梅花品种花粉萌发作用不显著，而高质量浓度（≥100 g/L）蔗糖对花粉萌发和花粉管生长有明显的抑制作用。任广兵等[8]研究了不同离体萌发培养液对梅花花粉萌发的影响，结果表明，10%蔗糖＋0.01%硼酸适合多数品种花粉离体培养。绿萼梅作为梅花中一个非常重要的品种群，其观赏性独特，受到大众的青睐。目前对绿萼梅花粉的萌发鲜有研究。

本研究以绿萼梅为试验材料，以蔗糖、硼酸、氯化钙和PEG 4000 溶液浓度为影响因素，采用液体培养基离体培养的方法，探索不同激素配比对梅花花粉萌发的影响，以期研究出适宜绿萼梅花粉离体培养的液体培养基，为梅花有性杂交提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为绿萼型梅花，取自郑州市植物园。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉采集 2018 年3 月初，天气晴朗时采摘含苞待放的梅花花朵，用镊子拨开花瓣，取下花药，在硫酸纸上平摊成薄薄一层，置于60 W 白炽灯下加热6～8 h，待花粉自然散落后，用尼龙网筛得花粉，收集到离心管中，标明时间，放入装有硅胶干燥剂的自封袋中，在-20 ℃冰箱中贮存。

1.2.2 花粉活力测定 采用离体萌发测定法进行液体培养，测定不同浓度的蔗糖、硼酸、氯化钙、PEG 4000 对花粉萌发的影响，根据因素水平（表1），按照L9（34）设计正交试验（表2）。根据不同处理，配制不同浓度的花粉离体萌发培养液，以清水培养为对照。

表1 花粉离体萌发培养液因素及水平

表2 花粉离体培养正交试验设计

用移液枪将花粉培养液滴在双孔凹玻片上，用毛笔蘸取少量待测花粉，将其置于培养液中，使其均匀散开；在培养皿底部铺上单层湿滤纸，将双孔凹玻片放入培养皿中，盖上培养皿盖，置于25 ℃光照培养箱中培养4 h 后在光学显微镜下进行镜检观察[9]。每个处理重复6 次，每个重复选择3 个视野进行观察，每个视野统计的花粉总数不少于60 个。花粉萌发的标准按照花粉管长度超过花粉直径2 倍计算[10]。按照花粉萌发率的计算公式，计算每个视野的花粉萌发率。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理间花粉萌发率差异性比较

由表3 可知，培养4 h 后，对照组花粉萌发率为35.69%，不同激素配比处理的花粉萌发率在36%～55%，均高于对照组。其中，萌发率最高的为1 号培养基，萌发率为54.34%，激素配比为蔗糖20 g/L＋硼酸150 mg/L＋氯化钙10 mg/L＋PEG4000 15 g/L；萌发率最低的为4 号培养基，萌发率为36.92%，激素配比为蔗糖15 g/L＋硼酸50 mg/L＋氯化钙30 mg/L＋PEG 4000 15 g/L；7 号和3 号培养基与6、8、4 号培养基间差异显著，1 号培养基对萌发率的影响与其他培养基之间差异极显著（P＜0.01）。说明1 号培养基与其他培养基相比最适合梅花花粉离体培养。

表3 不同处理间花粉萌发率差异性比较 %

2.2 不同因素对花粉萌发率的影响

从表4 可以看出，蔗糖和硼酸质量浓度对梅花花粉萌发率有极显著影响（P＜0.01），氯化钙和PEG 4000 质量浓度对绿萼梅花粉萌发率影响不显著（P＞0.05）。结合单因素统计，蔗糖质量浓度为20 g/L时，萌发率最高，硼酸质量浓度为150 mg/L 时，萌发率最高，且均显著高于其他2 个较低质量浓度下的萌发率，说明高质量浓度的蔗糖和硼酸对花粉萌发可能有促进作用，但还需要进一步试验证明。氯化钙质量浓度为10 mg/L 时，萌发率最高，PEG 4000 质量浓度为15 g/L 时，萌发率最高，但与其他2 个水平下的萌发率差异不显著。通过试验分析得出，在正交试验所有处理中，最适合梅花花粉离体萌发的激素配比为蔗糖20 g/L＋硼酸150 mg/L＋氯化钙10 mg/L＋PEG 4000 15 g/L。

表4 不同处理间的方差分析

2.3 激素配方优化

由上述试验可以看出，高质量浓度的蔗糖和硼酸对花粉萌发可能有促进作用，为进一步研究出更加适合花粉萌发的蔗糖和硼酸浓度，探讨高质量浓度蔗糖和硼酸对花粉萌发的作用。在上述试验的基础上，对蔗糖和硼酸质量浓度进行优化，蔗糖质量浓度设3 个水平（20、40、60 g/L），硼酸质量浓度设3 个水平（150、300、450 mg/L），测定高质量浓度蔗糖和硼酸对花粉萌发的影响。

表5 蔗糖和硼酸对花粉萌发的影响

从表5 可以看出，蔗糖质量浓度为40 g/L 时，花粉萌发率最高，为64.31%；蔗糖质量浓度为60 g/L时，花粉萌发率为63.53%，且与40 g/L 间差异不显著；蔗糖质量浓度为20 g/L 时，花粉萌发率只有32.14%，与40、60 g/L 间差异极显著。由此可以看出，高质量浓度蔗糖能够促进花粉萌发，低质量浓度的蔗糖则会抑制花粉萌发。硼酸质量浓度为300 mg/L时，花粉萌发率最高，为52.18%；硼酸质量浓度为150 mg/L 时，花粉萌发率为33.73%；硼酸质量浓度为450 mg/L 时，花粉萌发率为36.86%，且150 mg/L与450 mg/L 的萌发率之间差异不显著，而均与300 mg/L 时的萌发率差异极显著。说明高质量浓度的硼酸对花粉萌发有促进作用，但质量浓度过高时对花粉萌发有抑制作用。激素配比为蔗糖40 g/L＋硼酸300 mg/L＋氯化钙10 mg/L＋PEG 4000 15 g/L可作为绿萼梅花粉萌发培养的最佳培养基。

3 结论与讨论

由于花粉包含了植物父本全部基因信息，因而，它对研究植物的生殖、遗传、进化以及育种有着非常重要的意义。而花粉存活、生长、萌发和发育的前提是花粉活力，由此可以看出，父本花粉活力的高低是育种成败的关键[11-12]。花粉离体培养需要一定的糖、硼酸和钙，不同植物花粉萌发的适宜培养基不尽相同，它们的浓度大小很大程度上影响着花粉的萌发和花粉管的生长[13]。多数植物花粉离体培养都需要蔗糖的作用，其主要体现在2 个方面：一方面蔗糖可以为花粉萌发和花粉管伸长提供营养物质；另一方面可以维持离体培养环境渗透压的稳定[14-15]。张彦书[16]通过试验发现，在适宜的温度条件下，蔗糖琼脂培养基浓度在5%～10%时，梅花的花粉萌发率最高，超过15%以上时，萌发率显著下降。本试验研究发现，绿萼梅花粉在高质量浓度蔗糖溶液（40、60 g/L）中培养时，萌发率显著高于低质量浓度（20 g/L），说明高质量浓度蔗糖对花粉萌发有促进作用，但40、60 g/L 对萌发率影响不显著。由于试验中设置的浓度梯度较少，还需要进一步试验研究更高浓度蔗糖对绿萼梅花粉萌发的影响。

在植物的生殖过程中，硼起到了重要的作用，花粉的形成、花粉管的萌发以及受精过程都与硼密切相关[17]。硼酸作为微量元素虽对花粉的萌发具有促进作用，但不是越多越好[18]。在花粉萌发过程中，硼酸的浓度对花粉萌发的影响很大，主要原因在于一方面硼酸有助于形成细胞外的Ca2+浓度梯度，另一方面硼酸可以加强对糖类的吸收[19]。李娟等[20]研究发现，当硼酸的质量浓度为300 mg/L 时，溲疏的花粉萌发率最高，当硼酸质量浓度继续升高时，花粉萌发率开始降低。这与本试验结果一致。

PEG 是一种高分子渗透剂，能使花粉内膜结构发生变化，改变膜表面的电荷，使膜的柔软程度和通透性提高，从而促进花粉萌发和花粉管生长[21]。不同浓度的PEG 所起的效果是不同的，浓度过高或过低均不利于花粉萌发生长。赵宏波等[3]研究发现，当PEG 4000 质量浓度为200 g/L 时，梅花花粉离体萌发率最高，质量浓度过高或过低均不利于花粉的萌发。张绍铃等[22]研究发现，PEG 4000 对花粉萌发及花粉管生长的促进效果最大，当培养基中不添加PEG 4000 时，果梅花粉萌发率较低，花粉管伸长长度较短。本研究结果表明，PEG 4000 可以促进花粉萌发，但是不同浓度之间差异不显著。

本试验结果表明，蔗糖和硼酸对绿萼梅花粉萌发率有极显著影响，氯化钙和PEG 4000 对绿萼梅花粉萌发率影响不显著；最适宜梅花花粉萌发的激素配比为蔗糖40 g/L＋硼酸300 mg/L＋氯化钙10 mg/L＋PEG 4000 15 g/L；高浓度的蔗糖和硼酸对花粉萌发有促进作用，但浓度过高会抑制花粉萌发。因此，为了提高以绿萼梅为父本的授粉坐果率，若采用人工喷雾的方法进行授粉，可在溶液中添加一定浓度的蔗糖、硼酸、氯化钙和PEG 4000 等，这样更有利于节省花粉和提高授粉效果。