表面增强拉曼散射技术无标记检测乳腺癌细胞来源外泌体

熊红莲，王茗祎，谢慧娴，颜倚媚，钟会清

(1.佛山科学技术学院 a.物理与光电工程学院; b.口腔医学院， 佛山528000；2.华南师范大学生物光子学研究院, 国家中医药管理局中医药与光子技术三级实验室， 广州 510631)

乳腺癌是危害女性生命的主要肿瘤之一，早期诊断和临床治疗可以显著提高病人的生存率。现有乳腺癌的成像诊断技术包括钼靶X射线和超声影像，但只能检测较小的肿块[1]。传统的血清肿瘤标志物糖类抗原(carbohydrate antigen 153，CA153)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)与乳腺癌抗原(breast cancer antigen 225，BCA225)等虽然可以检测到早期的乳腺癌，但特异性和敏感性较低，容易造成误诊和漏诊[2,3]。最近，液体活检已成为一种极具潜力的方法，可早期诊断疾病和监测患者的健康。该方法基于使用各种技术检测人流体循环中的肿瘤标志物，例如：循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)，循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体的鉴定和定量。其中，由于外泌体在人体液中的稳定存在，分析患者体内循环的外泌体被认为是一种创新且有前途的方法，可用于癌症的早期诊断。外泌体是活细胞分泌并排泄到胞外的微小囊泡，直径为40～150 nm[4,5]。外泌体的成分反映了释放细胞的组成成分，包括多种蛋白质、核酸等成分，以及特异性的 CD9、CD81、CD63、TSG101、HSP70、HSP90和miRNA 等生物分子[6]，可作为疾病诊断的新型标志物，是释放细胞的“指纹”物。已有研究表明外泌体在乳腺癌细胞生长、增殖和转移等过程中发挥重要作用[7]。有报道乳腺癌患者体液中外泌体的数量增多，其所携带的分子与正常乳腺上皮细胞释放的外泌体显著不同，尤其是核酸和蛋白质含量明显增加[7]。

目前外泌体的检测方法主要包括透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)，动态光散射(dynamic light scattering,DLS)，纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)，流式细胞仪和蛋白质印迹[8,9]。其中，外泌体的TEM检测是一项金标准，可以看到囊泡的形态和大小。但是SEM只能确定其存在，不能鉴别正常和肿瘤来源的外泌体。DLS和NTA也只能提供有关粒径和分布的信息。流式细胞术既可以分析粒径，还可以通过细胞荧光标记鉴定外泌体的来源和亚群。但是标准流式细胞术不能检测到小于300 nm的颗粒。而蛋白质印迹需要破碎外泌体后，间接测定其表达的特征蛋白，如四跨膜蛋白(CD9，CD63和CD81)，热休克蛋白等。因此肿瘤特异性的快速检测仍然是一项具有挑战性的任务。

拉曼光谱技术通过分子振动和转动产生的光谱信号就可获得分子的结构和物质的成分信息，样品无需标记。因悬浮在PBS中的外泌体含量极小，拉曼散射效应十分微弱，难以获得清晰的拉曼光谱。增加激光功率并延长曝光时间可以增强微弱的拉曼信号，但激光功率超过10 mW，易烧伤生物学标本[10]。表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)技术将大量的样品吸附在粗糙的金属表面，当激光束穿过悬浮胶体时，不仅可使拉曼信号增强1013～1014倍,还能够抑制生物样品荧光背景[11]。SERS技术具有灵敏度高、准确性好、操作简单等优越性能，为外泌体检测提供了新的希望。从理论上讲，来自各种不同来源的外泌体具有特定功能的生物大分子。这意味着来自各种来源的外泌体具有特定的分子表型，从而反映不同的SERS谱型。因此SERS技术与外泌体检测结合可区分不同细胞来源的外泌体。Park等[12]已经报道了应用SERS鉴别肺癌细胞来源的外泌体和正常细胞来源的外泌体的可行性。

本研究利用SERS技术检测了从乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A培养基上清中分离出来的外泌体，探索了SERS技术在乳腺癌中诊断的应用价值，比对了MCF-7和MCF-10A细胞来源的外泌体SERS光谱，同时筛选出两种不同细胞来源外泌体的特征光谱，最后分析特征性光谱的形成原因。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺上皮细胞MCF-10A和人乳腺癌细胞系MCF-7均购于上海中国科学院细胞库。表面增强的拉曼材料是纳米银增强基底，购于云洋光电(深圳)有限公司。图1是纳米基底的扫描电镜图，粗糙的表面可以增加纳米材料的表面增强能力。

图1 纳米银基底的扫描电镜图Fig.1 Scan electron microscope image of the silver film substrate

1.2 细胞培养

正常人乳腺上皮细胞MCF-10A采用DMEM/F12培养基(含10%HS、1%青霉素/链霉素、0.1%HCl、0.02%EGF、0.1%胰岛素、0.01%霍乱毒素),在37 ℃和5% CO2的条件下进行培养，当细胞密度达到大约70%时，用PBS对细胞洗涤3次，加入无血清DMEM/F12培养基，继续培养24 h，收集细胞培养上清液。

人乳腺癌细胞MCF-7在DMEM完全培养基中(含10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、链霉素100 μg/mL)，培养于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱内。当细胞密度达到大约70%时，用PBS对细胞洗涤3次，加入含10%无外泌体的胎牛血清(Gibco)DMEM培养基，继续培养24 h，然后收集细胞培养上清液。

1.3 培养基中外泌体的分离

本试验采用差速超速离心法从细胞培养上清液中分离外泌体。收集细胞培养基上清液转移至离心管中，于4 ℃下转速为1 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液转移至新的离心管中，于4 ℃下转速为2 000 r/min离心20 min，弃沉淀，上清液转移至新的离心管中，在4 ℃下转速为5 000 r/min离心30 min，弃沉淀，用0.22 μm微滤器过滤，留上清液，之后4 ℃下32 000 r/min超速离心90 min，低速离心获得的细胞培养上清液不足时，用PBS缓冲液补充配平。去上清液，将离心获得的沉淀用无菌PBS重悬。再次在4 ℃下32 000 r/min超速离心90 min，去上清液，用100 μL PBS重悬沉淀，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 外泌体的表征

透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM，日本电子株式会社JEM-1200EX)可视化测量外泌体大小；纳米跟踪仪(nanoparticle tracking analysis, NTA，Malvern，Nanosight LM 10)跟踪外泌体，分析其大小和浓度。吸取样本各10 μL滴加于铜网上，沉淀3 min，滤纸从边缘处吸去浮液，PBS漂洗后磷钨酸负染，常温干燥5 min，电镜成像。NTA仪器利用激光光源照射外泌体悬浮液，可观察到带有散射光的颗粒的布朗运动，并进行粒径计算，同时得到整个体系的粒径分布信息。用注射器吸取1 mL左右的样品，然后向样品池缓慢注入，设置参数，获取粒径分布结果。

1.5 SERS测量和数据处理

本试验使用雷尼绍公司的显微共聚焦拉曼光谱仪(Renishaw,inVia,UK)采集SERS数据。石英载玻片上置于激光共焦显微拉曼光谱仪的显微镜载物台上，纳米银基底置于石英载玻片上，然后将10 μL外泌体溶液滴于干燥的纳米银基底上，液滴消失后，基底表面为湿润状态，立即收集表面增强拉曼散射信号。拉曼信号采集的光谱范围为800～1 800 cm-1，激发波长为785 nm，采集次数2次，曝光时间4 s，激发光功率约为0.5 mW，以防止功率过大烧伤样品。所装备的显微镜为莱卡DM2500，物镜放大倍数50×。每个样品在不同的位置获得约30个SERS光谱。每次扫描前，均用硅片的520 cm-1峰进行校准。试验重复3遍。为了减少不同光谱强度的差异和更好地对光谱形状进行对比分析，所有的拉曼信号采集均在同一条件下进行。数据定量分析前，采用Vancouver拉曼谱处理软件对所有谱线进行基线校正及荧光背景扣除。为了便于比较不同外泌体样品光谱形状和谱峰的相对强度，用强度法对光谱进行了归一化处理。

2 结果与分析

2.1 MCF-10A来源外泌体和MCF-7来源外泌体外泌体的表征结果

采用透射电镜TEM观察外泌体的大小和形态；纳米跟踪仪(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测外泌体的粒径和浓度。图2a与图2b分别为MCF-10A和MCF-7来源外泌体的TEM图。在镜下观察，外泌体分布不均匀，体形态多变，测量大小在30～200 nm，脂质包膜膜结构完整，大多数都呈现出典型的杯状结构，数个MCF-7来源外泌体有聚集的现象(图2b)，这可能与TEM样品制样的沉淀过程有关。然后进一步利用NTA分析外泌体的大小和浓度，图2c为MCF-10A外泌体粒径图，可以发现外泌体主要分布在50～150 nm之间，中位值在130 nm左右，外泌体浓度约为4.8×108particles/mL。MCF-7外泌体粒径图可以发现极少量外泌体分布在40～50 nm之间(图2d)，主要分布在80～150 nm之间，中位值分布也在130 nm左右，外泌体浓度4.9×108particles/mL。但可以看到有少量的囊泡分布在200～400 nm之间，可能与外泌体的聚集有关。

图2 外泌体的表征Fig.2 The characterization of exosomes(a)MCF-10A来源外泌体的透射电镜图(TEM)；(b)MCF-7来源外泌体的TEM图；(c)MCF-10A来源外泌体的纳米跟踪仪(NTA)检测结果图；(d)MCF-7来源外泌体的NTA检测结果图(a)TEM image of MCF-10A-derived exosomes;(b)TEM image of MCF-7-derived exosomes; (c)NTA results of MCF-10A-derived exosomes;(d)NTA results of MCF-7-derived exosomes

2.2 吸附于纳米银表面的外泌体的SERS光谱

SERS技术检测得到为正常乳腺细胞MCF-10A来源外泌体和乳腺癌细胞MCF-7来源外泌体SERS光谱(图3)，主要差异反映在其核酸，蛋白质，脂类等谱峰的波数和相对强度的明显变化，两者的拉曼特征峰差异性显著。MCF-10A外泌体和MCF-7外泌体SERS特征谱分别如图3a和图3b所示。由于外泌体包含相同的整体结构和大分子(脂质，蛋白质，核酸等)，因此在800～1 800 cm-1区域有共同的拉曼谱峰，858、938、999、1 032、1 318、1 602和1 655 cm-1，其分别归属于酪氨酸，脯氨酸和缬氨酸，苯丙氨酸，胶原或者脂类，核酸，酪氨酸和苯丙氨酸，蛋白的酰胺I带[13]。MCF-10A来源外泌体和MCF-7来源外泌体的特征峰归属见表1。

表1 外泌体拉曼光谱谱峰归属Tab.1 Band position and assignment of exosomes from 800～1 800 cm-1

2.2.1 核酸分子的谱线的变化

1 031 cm-1谱带源于核酸分子C- C键的拉伸振动，1 336 cm-1谱线归属于多核苷酸链。同时出现在MCF-7外泌体中的1 031 cm-1，1 336 cm-1处的拉曼峰，再一次证明MCF-7外泌体中的核酸显著高于MCF-10外泌体。

2.2.2 蛋白质分子类谱线的变化

MCF-10A来源的外泌体中蛋白质的酰胺I带特征谱带位于1 655 cm-1处，而MCF-7来源的外泌体的谱峰频移到1 642 cm-1处。该峰反映了蛋白质构象的α-螺旋和β-折叠结，无规则卷曲等特征。MCF-7来源外泌体在1 642 cm-1处的峰强虽无明显变化，但位于938 cm-1的肽链骨架 C-C键振动峰却明显变弱。酰胺I带和肽链骨架的特征拉曼峰与蛋白质的二级结构有关，是研究蛋白质二级结构的灵敏探针。肽链骨架峰强相对于酰胺I带的减弱会导致蛋白质结构的无序性[25]。

在MCF-7外泌体的SERS光谱中还可以清楚地看到酪氨酸谱线由正常乳腺癌上皮细胞MCF-10A的853 cm-1处频移到 857 cm-1，归属于色氨酸谱带1 336 cm-1处的强度也有明显的升高。这些谱线强度的增加表明癌变组织中氨基酸残基含量增加，成为蛋白质拉曼光谱的主要贡献者。值得注意的是，1 372 cm-1出现在MCF-10A来源外泌体峰谱中，该谱带的存在说明色氨酸残基的吲哚环呈埋藏式。而在MCF-7来源的外泌体中此特征峰消失，这说明氨基酸残基所处的肿瘤微环境发生变化使色氨酸残基的埋藏式吲哚环变为暴露式[26]。

2.2.3 脂类分子谱线的变化

正常乳腺上皮细胞外泌体中归属于脂类的特征谱线位于1 754、1 446和1 318 cm-1，而癌变组织中只观察到1 318 cm-1处的峰蓝移到1 315 cm-1，且峰发生了分裂。这些脂类分子可能主要来源于组织中的脂肪，这些谱线消失表明癌变组织中脂肪成分所占比例减少。另外，我们还观察到在正常MCF-10A来源的外泌体中可见较强的1 372 cm-1(碳水化合物)，但是在MCF-7外泌体谱线却观察不到此峰。这可能是癌细胞的代谢比正常细胞活跃。

图3 外泌体的表面增强拉曼散射(SERS)特征光谱Fig.3 The characteristic SERS spectrum of exosomes(a)MCF-10A来源外泌体SERS光谱;(b)MCF-7来源外泌体SERS光谱(a)SERS spectrum of MCF-10A-derived exosomes;(b)SERS spectrum of MCF-7-derived exosomes

3 讨论

SERS技术是一种灵敏度度高、无标记、无损伤、简单快速检测物质成分的方法，能够获得清晰的良恶性细胞来源外泌体的拉曼特征光谱，从而协助诊断良恶性细胞肿瘤。普通的拉曼光谱技术也有极高的灵敏度，但血清和培养基上清中纯化外泌体数量极少，获得外泌体的特征谱不够清晰，难以对疾病进行正确的评估。我们用SERS技术检测了MCF-10A和MCF-7来源的外泌体，并绘制了800～1 800 cm-1频移区段SERS光谱图。通过分析比对方式寻找出了肿瘤细胞MCF-7来源外泌体的特征性拉曼光谱，然后对特征性光谱的可行性及其物质归属进行匹配。拉曼光谱是物质成分的表观显示，物质成分的变化使拉曼光谱波形数量和强度的改变以及波峰的频移[27,28]。核酸、蛋白和脂类是构成外泌体表面的主要分子。这些物质成分在含量、结构、成分、表观遗传学发生任何变化，都可能会引起拉曼光谱的变化，导致SERS特征明显不同。此前，Joseph等[29]已用SERS技术检测了细胞与健康人血清和早期胰腺癌病人血清来源的外泌体，获得了清晰的拉曼特征谱，成功的区分了不同来源的外泌体。在本研究中，也能观察到SERS特征光谱明显的改变。例如，归属为双螺旋DNA骨架磷酸二酯的对称伸缩振动的拉曼峰，在正常乳腺上皮细胞MCF-10A来源外泌体拉曼光谱的1 067 cm-1处，而乳腺肿瘤细胞MCF-7来源外泌体特征谱中红移到1 072 cm-1处，且拉曼峰明显变宽变高。核酸是关键的遗传物质，核酸任何成分的增加或减少或结构构象的改变代表细胞新陈代谢和基因完整性发生变化。MCF-7中核酸的明显增加表明了肿瘤细胞大量分裂繁殖。另外，相比MCF-10A外泌体，MCF-7中归属蛋白质肽链骨架938 cm-1处的拉曼峰变弱，表明了蛋白质结构的无序性。癌细胞旺盛的代谢消耗了大量的脂类，其分泌的外泌体的脂类拉曼峰也显著变弱。良恶性细胞外泌体富含的蛋白质、核酸(DNA或RNA)及脂类的变化都会引起拉曼光谱的变化能够协助鉴别良恶性肿瘤[30]。

本研究建立了一种基于外泌体和SERS技术的快速无损检测方法，外泌体中的成分反映了释放细胞的组成成分，通过分析比对SERS拉曼光谱，可用于区分正常和肿瘤来源的外泌体，进而协助诊断早期肿瘤。这项研究表明SERS技术可为癌症的早期检测和诊断提供了一种快速、无标记和无损的方法。

但该试验和结果也有一定的局限性。首先我们仅仅选取乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞来源的外泌体做比较，想要得更客观的结果，需要选择多种乳腺癌细胞系与乳腺上皮细胞的外泌体拉曼光谱做对比，甚至选择其他种类良恶性细胞外泌体拉曼光谱做对比，这样筛选出的特征光谱更为可靠。其次，我们用的是细胞培养基分离出来的外泌体，但患者血清提纯的外泌体更具有临床实际应用价值。因此，下一步的试验计划是收集健康人和肿瘤患者的血液样本，分离外泌体，然后用SERS技术进行检测和鉴别。