Linc00511 在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

杜 阳 李 良 周成友

东南大学附属中大医院江北院区(南京市大厂医院) (南京,210044)

宫颈癌是妇科临床常见生殖系统恶性肿瘤,发病率居女性恶性肿瘤第二位,死亡率仅次于乳腺癌[1]。长链非编码RNA(lncRNA)为长度超过200个核苷酸、无蛋白质编码能力的非编码RNA,能在选择性剪接、基因印记、核内运输、细胞分化以及RNA衰变等不同的生物过程中起重要作用[2]。相关研究表示[3],敲减linc00511会抑制宫颈癌细胞增殖,能有效降低肿瘤细胞对紫杉醇的抵抗力。因此,本研究检测宫颈癌患者Linc00511表达情况并分析其临床意义,为宫颈癌的早期诊断及临床靶基因治疗提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011年1月—2014年4月在本院确诊的92例宫颈癌患者的癌组织及其癌旁组织标本。纳入标准：①符合宫颈癌诊断标准[4]；②均经宫颈或宫颈管活检组织检查后确诊为宫颈癌；③年龄18～80岁。排除标准：①术前接受放化疗、内分泌、生物靶向治疗等抗肿瘤药物治疗患者；②合并生殖系统结核患者；③合并严重肝、肾、心、血管功能疾病患者；④其他恶性肿瘤患者。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 治疗方案

92例宫颈癌患者均在术后采取紫杉醇类联合铂类药物规范治疗,耐药的复发患者接受二线化疗药物联合化疗。

1.3 组织中 Linc00511 检测

采用实时定量PCR法检测宫颈癌组织及癌旁组织中Linc00511表达。提取组织中RNA,加入500 μml TRIzol试剂裂解,置1.5 ml无酶EP管中。加入100 μl氯仿,室温静置3 min, 12000 r/min离心15 min；取200μl上层清液,置1.5ml EP管中,加入250 μl异丙酮混匀,静置10 min,于12000 r/min离心10 min；弃上清液,以含DEPC的75.0%乙醇溶液洗涤；洗涤沉淀3次后,待RNA沉淀基本透明后,加入不含RNase的ddH2O至充分溶解,测定RNA质量和浓度。按照Takara RR036A试剂盒说明书逆转录合成cDNA,并用CFX96实时PCR检测系统测定Linc00511。Linc00511上游引物5’-TCTCCTTGTGCAAACCTCC-3’,下游引物为5’-CCCACATTGAGCGAATGCC-3’；内参GAPDH上游引物为5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’,下游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’。反应体系(10μl)为2×iTaqTM Universal SYBR Green Supermix 5 μl,上下游引物(0.4μmol/L)各0.4μl,cDNA 0.8μl,RNase Free H2O 3.8μl。反应条件：95 ℃,30 s；95 ℃,5 s,60 ℃,30 s,共40个循环,65～95 ℃溶解曲线分析。3个复孔/次,重复3次。目的基因的表达采取2-ΔΔCt法进行相对定量,中位数以上为高表达,反之为低表达。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

92例患者年龄(46.4±8.6)岁(18～80岁)；其中腺癌28例,鳞癌64例；国际妇产科联盟(FIGO)分期Ⅰ期37例,Ⅱ期43例,Ⅲ期9例,Ⅳ期3例；分化程度为低分化13例,中分化27例,高分化52例；淋巴结转移20例,无淋巴结转移72例。

2.2 组织中 Linc00511 表达

Linc00511在宫颈癌组织中的表达量(3.26±1.17)高于癌旁组织中(1.14±0.83)(t=14.175,P<0.05)。

2.3 Linc00511 表达与病理关系

92例患者中,Linc00511高表达36例、低表达56例。在宫颈癌和癌旁组织中,Linc00511高表达与患者年龄、分化程度、病理分型无关(P>0.05),与FIGO分期、淋巴结转移、肿瘤大小有关(P<0.05)。见表1。

表1 Linc00511 高表达与相关因素关系[例(%)]

2.4 Linc00511 与患者生存关系

所有患者均在术后随访5年,患者5年生存率Linc00511高表达者(51.8%)低于Linc00511低表达者(72.2%)(χ2=3.909,P=0.048)。Linc00511高表达与低表达患者的中位生存时间均在5年以上,生存曲线见图1。

图1 生存情况分析

3 讨论

宫颈癌作为女性常见恶性肿瘤发病影响因素多,过程长,预后差,患者中位生存时间短,中晚期患者5年生存率在70.0%左右,是女性恶性肿瘤死亡的主要原因[5]。恶性肿瘤的分子生物学基础通常表现为促癌基因的激活与抑癌基因的失活[6]。随着近年来分子生物学领域的不断发展,分子生物学为恶性肿瘤的早期诊断、手术治疗效果及术后辅助治疗、预后评价等提供了一定依据。Ki-67[7]、Snail[8]、CK2β[9]等基因被发现与恶性肿瘤的预后关系密切。Linc00511是一种非编码RNA,敲减Linc00511能抑制多种癌细胞的增殖、迁移[10-11]。因此,为寻找更好的宫颈癌治疗新靶点,延长患者存活时间,本研究观察了Linc00511在宫颈癌组织中的表达及其临床意义。

近年来相关研究发现,多种lncRNA在人类肿瘤发生发展过程中存在异常表达,并充当调节剂的作用[12]。目前已有多种lncRNA在宫颈癌发生发展中发挥重要作用的研究报道,如：LncRNA H19在宫颈癌中的表达明显升高,且术后其表达量明显降低,可作为宫颈癌临床诊断和术后监测潜在的循环标记物[13]；lncRNA HOTAIR在宫颈癌细胞中的表达水平明显高于癌旁正常功能上皮细胞,而外源性敲低宫颈癌Hela癌细胞HOTAIR RNA表达对宫颈癌细胞的增殖与迁移均起到抑制作用[14]；最新研究发现[3],抑制Linc00511表达能抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭、迁移,促进宫颈癌细胞凋亡。本研究结果发现,宫颈癌组织中Linc00511表达量高于癌旁正常组织。与上述研究[3]结果相似。说明Linc00511可能是作为促癌基因,在宫颈癌的发生发展过程中发挥重要作用。

本研究将Linc00511在宫颈癌组织细胞中的表达水平按照中位数以上为高表达,以下为低表达进行区分,分析了Linc00511表达与宫颈癌患者临床病例特征的关系。结果发现,患者年龄、分化程度、病理分型与Linc00511高表达无关,FIGO分期、淋巴结转移、肿瘤大小与Linc00511高表达关系密切。提示Linc00511可能是促进宫颈癌发展与转移的重要因素,可作为宫颈癌进展及转移风险的一个预测因子。生存曲线对比情况显示,Linc00511高表达患者5年生存率低于Linc00511低表达患者。说明Linc00511高表达可能是宫颈癌患者预后死亡的高危因素,是宫颈癌临床治疗及预后的潜在靶点。但本研究Linc00511高表达与低表达患者的中位生存时间均在5年以上,说明两组患者预后情况均较佳,这可能与本研究纳入的患者相对集中在TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期有关。

综上所述,Linc00511在宫颈癌组织中呈高表达,表达水平与分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关,同时对宫颈癌患者的预后有一定价值,为宫颈癌的基因靶向治疗提供新的思考方向。