全自动酶免分析仪校准方法的研究

管善国 陈 霈 孙文斐

酶联免疫吸附测定方法是以酶免疫技术为基础发展出的一种新型的免疫测定技术，依据酶标记的免疫复合物与酶的响应底物能够产生显色反应，显色程度与被测样品中待测抗体(或抗原)的含量有关，根据显色物吸光度值确定待测物质含量，不同待测显色物质有其各自的特征吸收谱线，并符合郎伯-比尔定律(Lambert-Beer law)，可通过吸光度的测量实现含量分析。酶标分析仪即用此原理，在临床上可实现肝炎、艾滋病病毒、梅毒、肿瘤标记物以及风湿免疫类系列等数种病理诊断，具有灵敏度高，特异性强等特点。

由于分析过程中试剂样品的定量加注、恒温孵育过程较为耗时，工作量繁复，由此产生了集样品试剂自动分配、孵育温度控制以及吸光度测量为一体的全自动酶免分析仪，大幅提高了效率，随着生产技术的提高，成本降低，生产厂家和型号不断增加，其社会拥有量增多，在综合医疗机构已有取代酶标仪的趋势。

全自动酶免分析仪主要由仪器柜、装载塔、样品和试剂区、酶标板传送系统、恒温孵育仓、洗板机、比色器、读数器、计算机和内部条码扫描器组成。仪器通过加样、温育、洗板、加酶标物、加显色剂、加终止液和比色过程获得分析结果。其中比色器实现吸光度的测量，是最终测量结果的引用数据；洗板机实现洗板、加酶标物、加显色剂以及加终止液功能，其洗板效果、加注试剂样品的准确性直接影响测量结果；恒温孵育仓实现样品的预温功能，由于测量时需保留样品盒试剂原免疫活性与酶活性，对温度设定和控制需要保证准确可靠。其他部分实现样品贮存流转和数据处理功能。

目前，尚无针对全自动酶免分析仪的检定规程或校准规范。因此，根据仪器结构特点和工作原理，其校准工作主要包括吸光度和波长的校准、洗板机性能、注样精度校准和孵育温度校准三部分。由于国家计量检定规程“酶标分析仪”(JJG861-2007)[1]中已经规定了酶标仪中吸光度和波长的检定校准方法，在全自动酶免分析仪中关于吸光度和波长的校准方法可以参照该规程执行，但全自动酶免分析仪的洗板机性能和孵育温度尚无校准方法。因此，将重点讨论洗板机性能和孵育温度的校准方法。

1 吸光度示值和波长校准

1.1 校准设备

校准设备使用酶标分析仪标准测试板、干涉滤光片和分光光度计。

1.2 校准方法

仪器比色系统实现吸光度测量，主要由光源、单色器、样品室和检测器构成。单色器有单波长和连续可调式，依据国家计量检定规程“酶标分析仪”(JJG861-2007)[1]可实现全自动酶免分析仪吸光度示值误差示值稳定性和重复性、波长示值误差和重复性、灵敏度以及通道差异的校准。进行吸光度示值误差、示值稳定性和重复性测试时，将标准吸光度板放入传送带，送入比色室，选取单一波长、吸光度测量模式以空气作空白，即可读取数据并判定结果。波长校准时，对连续波长方式由短波向长波逐点测出标准滤光片的波长-吸光度值，求出相应峰值波长，计算其误差。对单波长方式，用分光光度计测量仪器所带波长滤光片透过率，绘制波长-透射比特性曲线，计算其峰值结果。

2 洗板机性能校准

洗板机利用压力泵正负压将清洗液定量注入微孔板容器内对其进行清洗，再将微孔板容器内的清洗液吸入废液瓶内，通过设定的重复清洗过程使微孔板达到清洁，其加注系统可实现加酶标物、加显色剂和加终止液功能。根据冲洗压力、冲洗距离、冲洗时间、震荡、涡流、底部冲洗、两点吸液以及连续式冲洗等需要可选择多种方式。

洗板机主要由以下4部分组成：①控制显示系统，设定工作程序、显示设置参数以及计时等功能；②负压系统，提供清洗液和废液回收；③加注系统，可自动定位、注液和吸液；④微孔板架。加注系统具有精密定量注液和吸液功能，注液是洗板机向微孔内注入设定的液体体积，吸液是抽吸后的微孔内液体，其残留液体越少越好。微孔板由多个微量器皿连接组成，用于盛装微量液体供分析使用。洗板机主要参数有注液量、吸液残留量、洗板次数、浸泡时间、延迟时间、吸液时间以及自动预洗间隔时间等。其中，注液量、吸液残留量关系洗板效果，可改变试剂浓度，对后续检验的准确性具有重要影响。由于目前计时技术已达到毫秒或微秒水平，其以秒计时的误差可忽略，故暂不考虑计时参数校准。

根据洗板机的工作原理，其主要特点是小液体的反复加液和吸液，经过一定工作时间后其负压系统稳定性会发生改变，吸液效果降低。使用中清洗头难免会有污染，从而影响加液准确性，而用户无法自行检测发生的变化，会对检验结果的准确性产生较大影响。因而有必要采用科学合理的方法进行校准，根据洗板机特点，可参照国家检定规程“移液器”(JJG646-2006)[2]中容量测量方法，采用衡量法进行加液量和残液量准确性的校准，此次主要校准内容为加液量的准确性和残留量以及通用要求。

2.1 主要技术要求

根据多数仪器技术指标和《广东省洗板机产品注册技术审查指导原则》(试行)[3]中主要技术要求为以下4项：①注液量最大允许误差应≤±5%；②注液量重复性应≤2.5%；③吸液残留量应≤3 μl/孔；④吸液残留量重复性应≤1.5 μl/孔。

2.2 校准条件

(1)室温(20±5)℃且室温变化应＜1 ℃/h，相对湿度为40%～80%。不应有明显风速和影响天平工作的振动，避免阳光照射，同时实验室不应有影响天平正常工作的磁场和振动，且周围无腐蚀性气体和液体。

(2)校准介质应符合国家标准“分析实验用水规格和实验方法”(GB6682-2008)要求[4]的蒸馏水或去离子水，其温度与室温应≤2 ℃。

2.3 校准设备

洗板机校准所用设备选用Ⅰ级电子天平和分度值为0.01 ℃的数字温度计。

2.4 校准项目和校准方法

(1)外观检查。被校准的装置不应有影响正常工作的机械损伤，各控制开关灵活可靠，微孔板可稳定放置于工作面且动作正常。

(2)注液量最大允许误差和残留量的校准。尽量选择单注液和单吸液方式，应在覆盖注液量范围内选取不少于两个校准点或根据客户要求选取校准点。校准时选取相应未使用的微孔板，称量空板，反复洗板2次。分别称量加液后和吸液后的质量，每次称量前应用吸水纸吸附微孔板底部的水分，重复操作称量6次。校准过程中实验用介质温度波动应≤±1 ℃，目测微孔板注液面和残留液面应无明显差异。每次称量并计算注液量(公式1)和残留量(公式2)：

式中VI为被检仪器的注液量(μl)，VC为被检仪器的残留量(μl)，m1，m2，m3分别为天平称量的空板、注液后和抽液后的微孔板质量(mg)，k(t)为蒸馏水的温度密度系数，N为选取测量的微孔数。

注液量相对误差计算为公式3：

式中V0为设定注液量(μl)，为6次注液量的算术平均值(μl)。

(3)注液量和残留量的重复性校准。重复性计算为公式4：

式中Vi为每次测量的注液量或残留量值为注液量或残留量的算术平均值(μl)，n为测量次数。

(4)洗板机校准中的功能选择。校准过程中不选用振动及浸泡功能，尽量避免沾带水份，取出酶标板后称量应迅速，以减少液体挥发，实验证明在稳定环境中，30 s的测量时间对称量结果可忽略不计。随时检查废液瓶中的废液，应该在废液超出三分之二时，及时将废液倒掉。

3 孵育温度的校准

3.1 技术要求

参照国家计量技术规范“环境试验设备温度、湿度校准规范”(JJF1101-2003)[5]方法及仪器技术要求，温控精度为±0.2 ℃，温度波动性为±0.1 ℃。由于仪器样品室空间较小，可选择中心单点测量，温度均匀性未做考虑。

3.2 校准方法

将数字温度计探头置于孵育箱内样品中心位置，将仪器温度设定到所需温度，待仪器工作正常温度显示稳定后开始读数，每2 min记录1次，30 min共测试15次。

3.3 温度偏差计算

温度偏差计算为公式5：

式中Δtd为温度偏差(℃)，td为中心点n次测量的算术平均值(℃)，t0为设备显示温度的平均值(℃)。

3.4 温度波动度计算

以30 min内(2 min/次)样品中心点实测最高温度与最低温度之差的一半，其计算为公式6：

式中Δtf为温度波动度(℃)，t0max为中心点n次测量的最大值(℃)，t0min为中心点n次测量的最小值(℃)。

4 校准中的注意事项

在吸光度校准时应避免采用振动模式，随时注意标准滤光片是否有污染。为保证洗板机的性能可靠，使用中应注意保护清洗头，并注意与空板的位置是否偏移，样品池在酶标仪板中是否放置水平，酶标板应平稳放置在载架中间。运行时要随时检查废液瓶中的废液，应在废液超出三分之二时及时将废液倒掉。关机前用蒸馏水进行至少5次清洗洗板机内部操作，关机后将洗液瓶内的洗液移出，避免结晶后堵塞洗板头。如果洗板机较长时间不使用时，需将洗板头拔下，泡于蒸馏水中。

5 结论

随着医疗机构近年来全自动酶免分析仪使用量的不断增加，仅依据国家计量检定规程“酶标分析仪”(JJG861-2007)[1]对全自动酶免分析仪开展校准工作已不能满足实际检测需求[6]。此次重点对全自动酶免分析仪吸光度、波长之外的洗板性能和温度指标校准技术进行了探讨和完善。根据提供的方法，在实际校准工作中可及时发现在用洗板机功能负压系统的稳定性变化、加液量准确性以及残留量的异常，指导客户或维修单位及时查找原因排除故障，为保证临床检验结果准确提供良好的技术支持。