大豆7S球蛋白的MTGase条件对其表面疏水性与功能特性、溶液性质的影响及相关性分析

范丽丽,窦博鑫,张晓琳,徐晨冉,芦志凤,刘 颖

(哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)

大豆贮藏蛋白占大豆籽粒的40%～45%,含有人体不能合成的8种氨基酸,其营养价值较高,被称为“植物肉”[1-4]。大豆7S球蛋白(β-伴球蛋白)是大豆蛋白的主要贮藏蛋白,分子量为180～200 kDa的糖蛋白[5],由α、α′和β亚基通过疏水键和氢键结合形成三聚体[6]。

近年来许多研究已经表明,通过酶的改性可以改善大豆蛋白的功能特性,如乳化性、起泡性等[7],Ikura等报道了豚鼠来源的TGase催化11S大豆球蛋白和7S球蛋白聚合,结果显示TGase催化7S聚合的速率要明显优于11S,同时指出TGase催化酸性亚基和碱性亚基的速度不同,只有酸性亚基能被TGase聚合[8];Tang等利用MTGase交联改性富含7S球蛋白的大豆分离蛋白(SPI),结果显示7S球蛋白含量高的SPI凝胶结构主要通过依靠疏水键和氢键维持,改性后凝胶透明度有所提高[9],但是通过酶改性对蛋白结构和功能特性相关性的研究很少有报道。探讨MTGase交联改性大豆7S球蛋白的乳化性、溶液性质和结构对大豆7S球蛋白表面疏水性的关系影响很大。

本研究以大豆7S球蛋白为研究对象,以微生物转谷氨酰胺酶(MTG)酶添加量、pH、温度为单因素交联处理大豆7S球蛋白,分别测定其表面疏水性、乳化性、乳化稳定性、流体动力学粒径、Z-电位,并对蛋白质表面疏水性与乳化性、乳化稳定性、流体动力学粒径、Z-电位进行相关性分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低温脱脂大豆粕 山东禹王有限公司;MTGase(活性130 U/g) 江苏瑞欣食品生物科技有限公司;1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS) Sigma公司进口;K2HPO4、KH2PO4、NaCl 优级纯;其余试剂 均为分析纯。

F-7000FL220-240V荧光光谱仪 Watter公司;Alpha1-2冷冻干燥机 锡山市林洲干燥机厂;TG16-WS高速离心机 上海市卢湘仪离心机仪器有限公司;722S型分光光度计 上海市精密科学仪器有限公司;恒温加热磁力搅拌器 北京市科伟永兴仪器有限公司;Malvern激光粒度仪 上海市思百吉仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆7S球蛋白的制备 参照刘春等[10]的方法制备大豆7S球蛋白。

1.2.2 MTGase交联处理大豆7S球蛋白

1.2.2.1 MTGase添加量对大豆7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响 将制得的7S球蛋白,溶于0.01 mol/L、pH7.0的PBS缓冲液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,调pH至7.0,然后分别加入10、20、30、40、50 U/g MTGase,聚合物在55 ℃下反应2 h后,80 ℃水浴5 min,灭酶,测定MTGase添加量对蛋白质表面疏水性、乳化性、乳化稳定性、平均粒径和Zeta电位的影响[11-13]。

1.2.2.2 pH对大豆7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响 将制得的7S球蛋白溶于0.01 mol/L、pH7.0PBS缓冲液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,分别调pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,分别加入20 U/g MTGase,聚合物在55 ℃下反应2 h后,80 ℃水浴5 min,灭酶,测定不同pH对蛋白质表面疏水性、乳化性、乳化稳定性、平均粒径和Zeta电位的影响。

1.2.2.3 温度对大豆7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响 将制得的7S球蛋白,溶于0.01 mol/L、pH7.0 PBS缓冲液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,调pH至7.0,加入20 U/g MTGase,聚合物分别在40、45、50、55、60 ℃下反应2 h后,80 ℃水浴5 min,灭酶,测定不同温度对蛋白质表面疏水性、乳化性、乳化稳定性、平均粒径和Zeta电位的影响。

1.2.3 指标测定方法

1.2.3.1 表面疏水性的测定 采用ANS荧光探针法[14]测定蛋白质的疏水性。将MTGase交联处理大豆7S球蛋白样品溶于0.01 mol/L、pH7.0的PBS缓冲液中,制成0.005%、0.01%、0.02%、0.1%、0.2%(W/V)的溶液。取样品液4 mL,加入50 μL 8 mmol/L ANS,充分振荡后,室温下静置3 min。荧光发射光谱测试条件:采用290 nm为激发光波长,扫描范围300～400 nm,激发狭缝宽5 nm,发射狭缝5 nm测定荧光强度。以蛋白质质量浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标制作曲线,曲线初始阶段的斜率即为蛋白质的表面疏水性指数(S0)。

1.2.3.2 乳化性和乳化稳定性的测定 配制1%(W/V)的MTGase交联处理大豆7S球蛋白溶液,取15 mL样品溶液与5 mL大豆油置于烧杯中混合,在高速剪切均质机下10000 r/min乳化2 min,形成均一的乳化液。室温下,分别于静置后的第0和第30 min取20 μL的乳状液与5 mL 0.1%SDS溶液均匀混合，取样点固定在离烧杯底部0.5 cm处,在500 nm波长处测定其吸光值,分别记为A0和A30,用0.1%的SDS做空白对照[15-16]。

计算公式如下:

式中:T-2.303;N-稀释倍数,250;C-乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质质量浓度,g/mL;φ-乳化液中油的体积分数,0.25。

式中:A0-所得样品后直接测吸光值;A30-放置30 min后重新吸取所测的吸光值。

1.2.3.3 粒径分布的测定 根据李杨等[17]的方法,采用马尔文激光粒度分析仪测定MTGase交联处理大豆7S球蛋白的流体动力学粒径及其分布。将蛋白质样品用pH7.0的磷酸盐缓冲液配制成0.1%的蛋白溶液,过0.45 μm水系醋酸纤维素滤膜,室温下进行测定,取3次测定的平均值。

1.2.3.4 Zeta电位的测定 根据Crudden等[18]的测定方法,采用马尔文电位仪测定MTGase交联处理大豆7S球蛋白溶液的Zeta电位。将7S球蛋白样品用缓冲液稀释至质量分数为0.2%,上样体积为1 mL,测定温度为25 ℃,温度平衡时间为2 min。

1.2.4 MTGase交联处理7S球蛋白相关性分析 将经MTGase交联处理的大豆7S球蛋白分别测定蛋白质表面疏水性、乳化性、乳化稳定性、平均粒径和Zeta电位后,对MTGase交联处理的大豆7S球蛋白蛋白质表面疏水性与乳化性、乳化稳定性、平均粒径、Zeta电位进行相关性分析。

1.3 数据处理

实验数据的统计分析包括单因素方差分析和相关性分析,均采用SPSS 17.0软件,方差分析差异性显著(P<0.05)时采用Duncan方法进行多重比较。图谱的分析处理和图表的制作采用Origin 8.5软件进行。

图1 不同MTGase酶添加量对7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响Fig.1 Effect of different MTGase enzyme additions on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.对表面疏水性的影响;b.对乳化性和乳化稳定性的影响;c.对平均粒径的影响;d.对Zeat电位的影响。

2 结果与分析

2.1 MTGase交联处理对7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响

2.1.1 MTGase酶添加量对7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响 蛋白质的表面疏水性是由于蛋白质中许多氨基酸残基侧链趋向于聚集,暴露于蛋白质表面引起的,是两个不溶于水的分子间的相互作用,是衡量蛋白质功能性质的关键指标之一,即蛋白质的表面疏水性与蛋白质的功能、结构特性等密切相关[19-20];从图1a可以看出,随着加酶量不断增大,蛋白质表面疏水性不断增加,加酶量为20 U/g时疏水性增加到最大值,继续增大加酶量蛋白质表面疏水性降低,分析原因是MTGase催化7S球蛋白的活性明显增强,使埋藏于蛋白质分子内部的MTGase的有效作用位点暴露于MTGase,从而使蛋白质聚合速率增加,聚合物分子量不断增长,在20 U/g时聚合物达到最大,当聚合物分子量到一定值时可能会产生一定的空间位阻,降低MTGase对蛋白的三级结构影响,酶量继续增加,蛋白质不再聚合,蛋白质表面疏水性趋于稳定。这与姜巍巍[13]不同加酶量对不同大豆蛋白表面疏水性的影响分析结果一致。

大豆蛋白作为乳化剂被广泛应用于食品工业中,乳化性是大豆蛋白最重要的特性之一[21]。如图1b所示,随着加酶量不断增大,蛋白质乳化性不断增大,加酶量为20 U/g时乳化性增加到最大值,继续增大加酶量蛋白质乳化性降低,乳化稳定性降低。分析原因是7S球蛋白乳化性受蛋白质表面疏水性的影响,MTGase催化7S球蛋白的活性明显增强[22-23],使蛋白质表面疏水性增强,提升蛋白质对油脂的吸附速率,从而改善蛋白质乳化性[24],在酶添加量为20 U/g时乳化性达到最大,当酶添加量继续增大,MTGase酶聚合蛋白质能力达到饱和,产生一定的空间位阻,降低MTGase对蛋白的聚合速率,导致蛋白表面疏水性趋于稳定,乳化性不再改变。

在蛋白质聚集过程中,蛋白质的平均粒径不仅可以表征蛋白质的聚集程度,同时也能够反映出蛋白质空间构象的改变[25]。由图1c可以看出,7S球蛋白的平均粒径随MTGase酶添加量的增加,呈先增大后减小的趋势,由于酶的交联作用破坏了维持蛋白质的主要作用力如疏水作用、静电作用等,从而增加了蛋白质碰撞几率,使蛋白质分子聚集现象增加,聚集物增大,表现为蛋白质分子平均粒径的增大,在酶添加量为20 U/g时达到最大,酶作用趋于饱和,继续添加MTGase酶,产生空间位阻,蛋白质不再继续聚集,导致蛋白质平均粒径趋于稳定[26-27]。

图2 不同交联pH对7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响Fig.2 Effect of different pH on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.对表面疏水性的影响;b.对乳化性和乳化稳定性的影响;c.对平均粒径的影响;d.对Zeat电位的影响。

Zeta电位是蛋白质溶液中粒子表面和分散溶液之间的电势,通过蛋白质颗粒之间相互排斥或吸引[28]。由图1d可以看出,7S球蛋白Zeta电位绝对值均大于20 mV,说明其体系整体趋于稳定,而随MTGase酶添加量增加,电位绝对值先下降后增加,由于酶添加量增大加快蛋白质聚集速率,溶液变得不稳定,加快蛋白质疏水基团内卷,分子间静电斥力小于分子间引力,蛋白质Zeta电位值降低,随后由于酶催化活性降低,蛋白聚集作用降低,蛋白质之间静电斥力增大,体系趋于稳定,Zeta电位绝对值增大。

2.1.2 交联pH对7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响 预实验可知7S球蛋白的表面疏水性为1024,由图2a可以看出,随着pH不断增大,蛋白质表面疏水性呈现先下降后增大的趋势,当pH为5时表面疏水性降到最低,随后pH增大表面疏水性开始明显增加。可能是因为蛋白质是两性电解质,7S球蛋白的等电点为4.8,此时蛋白质在电场中不迁移,其分子正负电荷相等,净电荷为零,溶液中的蛋白质颗粒因不存在同种电荷的相互排斥[28],分子易凝聚而产生沉淀,从而影响MTGase酶对7S球蛋白的催化作用,酶损失严重,当pH大于小于5时MTGase酶对7S球蛋白催化作用增强,蛋白质表面疏水性增强。

预实验可知7S球蛋白的乳化性为23.99 m2/g,大豆7S球蛋白在碱性环境中的乳化性和乳化稳定性明显优于酸性环境,并且在pH为5时乳化性最低[29],这是因为7S球蛋白的等电点为4.8,而溶液的pH接近蛋白质的等电点时,溶解性降低,乳化性降到最低,此时乳化性值为20.33 m2/g,且唐传核[11]曾报道过MTGase在pH5.0～7.0范围内是相当稳定的,pH小于4.0或pH9.0时该酶不稳定,酶活损失严重,微酸状态更有利于该酶的催化活性,因此7S球蛋白的乳化性在pH大于或小于这一区域,乳化性开始增加[30-31],在pH6.0～7.0时趋于稳定。

预实验可知7S球蛋白的平均粒径为78.55 nm,由图2c可知随着pH不断增大,蛋白质平均粒径呈现先增大后下降的趋势,当pH为5时蛋白质平均粒径增加到最大,由于7S球蛋白的等电点为4.8,此时蛋白质颗粒在溶液中因没有静电排斥作用,蛋白质溶解度最低,分子容易凝聚而产生沉淀,使蛋白质分子平均粒径增大,大于或小于等电点时平均粒径减小,这与严江殷[32]pH对7S球蛋白粒度影响的结果相一致。

7S球蛋白的Zeta电位在pH3.0～7.0时,随pH增大先降低后增大,在pH为5.0时最低,分析是pH为5时比较接近7S球蛋白的等电点,蛋白质溶解度最低,此时蛋白易絮凝,蛋白质分子间作用力减弱,静电斥力减弱,从而使蛋白质Zeta电位降低,大于或小于此区域时Zeta电位值增大[32]。

2.1.3 交联温度对7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响 由图3可以看出,交联温度在45～55 ℃,蛋白质表面疏水性比较大,温度为55 ℃时疏水性增加到最大值,45、50、55 ℃时表面疏水性分别为1256.4、1260.7、1268.7,温度继续升高蛋白质表面疏水性降低,分析原因是因为温度的增加有利于大豆7S球蛋白结构伸展,同时温度增加会使MTGase催化交联作用增强,蛋白表面疏水性增强,但当温度继续升高时,MTGase发生热变性,使大豆7S球蛋白表面疏水性降低,这与姜巍巍[13]不同温度对大豆蛋白表面疏水性影响的结果相似。

图3 不同温度对7S球蛋白功能特性及溶液性质的影响Fig.3 Effect of different temperature on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.对表面疏水性的影响;b.对乳化性和乳化稳定性的影响;c.对平均粒径的影响;d.对Zeat电位的影响。

表1 表面疏水性对乳化性、乳化稳定性、平均粒径、Zeta电位的相关分析Table 1 Correlation analysis of surface hydrophobicity to emulsifying,emulsion stability,average particle size and zeta potential

注:*表示在0.01水平(双侧)上显著相关。随着交联温度不断增大,蛋白质乳化性不断增加,温度为55 ℃时乳化性增加到最大值,为31.29 m2/g,温度继续升高蛋白质乳化性降低,分析原因是因为温度的增加有利于大豆7S球蛋白结构伸展,同时MTGase在50～55 ℃时相对酶活呈直线增加[5,12],使MTGase催化交联作用增强,蛋白表面疏水性增强,从而改善蛋白质乳化性,但当温度继续升高时,MTGase发生热变性,使大豆7S球蛋白表面疏水性降低,也降低了其乳化性。

随着交联温度不断增大,蛋白质平均粒径不断增加,温度为55 ℃时平均粒径增加到最大值,为99.03 nm,温度继续升高蛋白质平均粒径降低,分析原因是热处理破坏了维持蛋白质结构的作用力,使大豆7S球蛋白结构伸展,同时温度增加有利于MTGase酶催化活性,蛋白质平均粒径增大,当温度继续升高时,MTGase发生热变性,在此温度下7S球蛋白分子聚集作用降低,使其平均粒径减小[28]。

随着交联温度不断增大,破坏了维持蛋白质结构的作用力,有利于大豆7S球蛋白结构伸展,蛋白质表面疏水性不断增加,蛋白质平均粒径不断增加,蛋白质分子间作用力减弱,静电斥力减弱[28],同时温度增加会使MTGase催化交联作用增强,增大蛋白质表面疏水性,同样会降低蛋白质之间的静电作用,导致蛋白电位降低,但当温度继续升高时,MTGase发生热变性,在此温度下7S球蛋白分子聚集作用降低,使其平均粒径减小,蛋白质之间静电斥力增强,Zeta电位增大,这与本实验中平均粒径的分析结果一致。

2.2 7S球蛋白表面疏水性与功能特性及溶液性质的相关分析

通过表1可知,蛋白质表面疏水性与乳化性、平均粒径、Zeta电位之间存在一定的相关性,这与刘春雷等[33]的实验结果分析相一致。相关性表明:蛋白质表面疏水性与乳化性存在正相关性,相关系数为0.718(P=0.003);而表面疏水性与乳化稳定性之间相关性不明显,相关系数为0.304(P=0.270)。分析蛋白质表面疏水性与乳化性的相关性,可能因为7S球蛋白具有丰富的疏水氨基酸含量,在其表面存在大量的疏水区,所以它能很快地吸附在油滴的表面,使7S球蛋白乳化性增加,而蛋白质表面疏水性和乳化稳定性没有相关性[34-35]。

相关性表明:蛋白质表面疏水性与平均粒径存在正相关性,相关系数为0.860(P=0.005)。分析蛋白质表面疏水性与平均粒径的相关性,可能因为蛋白表面疏水性越大,蛋白质分子之间的吸引力作用越大,蛋白质相互聚集程度越大,平均粒径越大,相反蛋白质表面疏水性减小,蛋白质平均粒径减小。

相关性表明:蛋白质表面疏水性与Zeta电位存在显著负相关,相关系数为-0.727(P=0.02)。当Zeta电位绝对值较低时,溶液中蛋白质分子表面电荷较少,蛋白质分子间静电斥力减弱,溶液中蛋白质颗粒倾向聚集,使蛋白质表面疏水性增大,相反蛋白质溶液Zeta电位绝对值较大时,蛋白质表面电荷增加,蛋白质分子间静电斥力增强,蛋白质表面疏水性增强[36]。

3 结论与展望

MTGase交联处理(酶添加量、pH、温度)大豆7S球蛋白,结果表明:酶添加量为20 U/g,pH7.0,温度55 ℃时,对其表面疏水性、乳化性、乳化稳定性和平均粒径影响较大,表面疏水性值为1268.7,乳化性值为31.29 m2/g,乳化稳定性值为225.05 min,平均粒径99.03 nm;通过相关性分析,大豆7S球蛋白的表面疏水性与乳化性成正相关,相关系数为0.718(P=0.003);而表面疏水性与乳化稳定性之间相关性不明显,相关系数为0.304(P=0.270);蛋白质表面疏水性与平均粒径存在正相关性,相关系数为0.860(P=0.005);与Zeta电位成负相关,相关系数分别为-0.727(P=0.02)。

(MTGase酶)改性技术是决定食品的色、香、味以及质构的一种重要手段。表面疏水性显著影响大豆蛋白质的功能特性及溶液性质,明确大豆蛋白质功能特性及溶液性质与表面疏水性的相关性,对今后开发特定功能性产品并进行分子设计和重组有重要意义。