超声波辅助喷雾加湿法富集发芽黑糙米生物活性物质工艺的响应面优化

雷 月,宫彦龙,邓茹月,张大双,刘雪薇,罗秦欢,朱速松

(贵州省农业科学院水稻研究所,贵州贵阳 550006)

黑糙米属全谷粒糙米,因其色素在种皮和谷壳上沉积而形成特有的色泽,营养丰富,尤其是米糠层富含酚类、各种维生素和氨基酸等[1-2]。相关研究表明,糙米虽可最大限度保留稻谷中的营养物质,但因其存在蒸煮耗时、食味品质不佳、不易消化等缺点,较难作为主食适应人们的饮食习惯[3-4]。发芽糙米是由糙米经一定条件处理后,在适当温、湿度下培养发芽,并经灭酶、干燥等工序处理后制成的一种糙米制品[5-6]。糙米在发芽处理过程中激活和释放了多种内源酶,并使其从结合态转化为游离态,进而促使糙米中γ-氨基丁酸、谷维素等生理活性物质的富集[7-9]。相对于糙米原料而言,经发芽后的糙米蒸煮性能、质构特性和食用品质均明显改善,营养价值得到极大提升[10-11]。

近几年,以富集发芽糙米中生物活性成分(尤其是γ-氨基丁酸)为目的,对糙米发芽处理工艺的研究主要集中在通过调节糙米浸泡处理条件,如超声波处理、酶解处理、低温、低氧、盐胁迫等逆环境处理等,从而实现发芽糙米生物活性物质的富集[12-14]。程威威等[15]探讨了选用5种不同的方法分别对发芽前的糙米进行前处理,发现臭氧处理对糙米发芽率的影响最大,搅拌浸泡处理对糙米中GABA含量的影响最大。张袆等[16]通过实验研究发现,经超声处理后发芽糙米GABA累积量和多酚提取量显著高于普通发芽糙米累积量和多酚提取量。有学者分别在低温胁迫及低温、低氧储藏条件下对发芽糙米GABA含量的影响进行了相关研究,发现低温胁迫及低氧储藏均有利于糙米发芽后GABA含量的积累[6,17]。浸泡处理虽能最大限度的保证糙米充分吸水发芽,但也存在吸水时间长、生产效率低等问题,且长时间浸泡处理不仅会造成糙米因吸水饱和,使其细胞结构受损,浸泡液中滋生大量细菌,还会导致糙米中水溶性营养成分的严重流失。利用酶解处理糙米发芽虽可有效改善糙米食用品质,提高糙米营养价值,但因酶具有专一性,故所选酶的种类必须依据糙米皮层粗纤维组分特征适当配比,否则将会制约其酶解效果[18]。逆环境胁迫处理是当前研究较多的处理方式,其中超声波作用属于逆境胁迫处理方式之一,有研究表明适当强度的超声波处理可显著促进糙米发芽前期GABA的富集,对发芽中后期富集作用不显著,糙米发芽过程中GABA含量变化主要取决于糙米自身发芽代谢[19]。

喷雾加湿法主要是通过一定的时间间隔连续的以水雾喷淋的方式对糙米进行加湿吸水发芽处理,既实现了糙米发芽所需的含水量,又可以避免糙米因长时间吸水造成的细胞结构破坏及水溶性营养物质大量流失等问题,从而在保证糙米充分吸水的情况下，尽可能保留其营养组分，同时提高其生产效率。

目前,已有学者对超声波处理积累发芽糙米GABA含量及发芽糙米主要成分变化等做了相关研究,但是针对超声波辅助喷雾加湿法富集发芽黑糙米生物活性物质的研究鲜有报道。本试验主要是在超声波作用的基础上,采用喷雾加湿法进行响应面优化试验,确定富集发芽黑米生物活性物质的最佳工艺参数,旨在为有色发芽糙米的研发和精深加工提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑糙米 品种名为特浓香,产自贵州省惠水地区，对2018年当季收获的黑米稻谷经糙米机脱壳处理后获得黑糙米,去除病虫霉变粒、不完整粒、沙石杂质和秕粒,挑选籽粒饱满、粒型均匀的糙米,进行抽真空包装并存放于4 ℃冰箱中备用；福林-酚试剂、没食子酸标准品、γ-氨基丁酸标准品(纯度≥98%) 北京索莱宝科技有限公司;无水乙醇、次氯酸钠(有效氯10%)、硼酸、硼砂、重蒸酚、盐酸、无水甲醇、无水碳酸钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

FC2K型糙米机 日本Yamamoto公司;PS-60AL型超声波清洗机 上海科榕实业有限公司;电子分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;SX-500型高压灭菌锅 基因有限公司;电热恒温干燥箱 上海光地仪器设备有限公司;RXZ智能型人工气候培养箱 宁波江南仪器厂;台式离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司;T6型紫外可见分光光度仪 北京普析通用仪器有限责任公司;HF-500A型高速多功能粉碎机 辰禾盛丰工贸有限公司;刻度喷壶 贵州博奥瑞杰生物科技有限公司;BCD-216SDN型冰箱 青岛海尔股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糙米的预处理 参考张冬媛等[20]、康文瀚等[21]方法略作改动。准确称取一定量筛选后的黑糙米,用自来水冲洗米粒表面的糠粉和灰尘等杂质并进行沥水后,用质量分数为1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒20 min,次氯酸钠溶液的加入量以能淹没黑糙米为宜,再用蒸馏水漂洗,直至溶液pH为中性,然后将糙米均匀的平铺在预先经灭菌处理的底部垫有3层灭菌纱布的培养皿中,并盖上3层灭菌纱布,备用。

1.2.2 发芽糙米及发芽糙米粉的制备 将预处理后的糙米在避光条件下,进行超声波辅助喷雾加湿处理,将处理后的糙米置于人工气候培养箱中进行发芽培养,设定人工气候培养箱的条件为:暗光,温度35 ℃,湿度95%,培养芽长至0.5～1.0 mm时终止发芽,将经过发芽后的糙米用超纯水冲洗2～3遍,沥水并在75～80 ℃的热水条件下灭酶10 min,沥干水分,再将沥水后的发芽糙米均匀的平铺于垫有干燥灭菌纱布的培养皿中,置于40 ℃电热恒温干燥箱中烘干至水分质量分数为13%～14%左右,即得到发芽黑糙米。将干燥后的发芽黑糙米于室温下通过高速多功能粉碎机进行粉碎并过100目筛,称重并用真空包装机封口包装,置于4 ℃条件下避光保存,备用。

1.2.3 富集发芽黑糙米生物活性物质的单因素实验

1.2.3.1 超声功率的选择 准确称取10 g筛选后的黑糙米,经1.2.1预处理后,在避光条件下,设定超声时间为90 min,超声温度为45 ℃,单次循环喷雾加湿量为10 mL,间隔时间为5 min,分别在超声功率为144、198、252、306、360 W时对黑糙米进行发芽前处理,并经1.2.2处理后,考察不同超声功率对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响。

1.2.3.2 超声时间的选择 准确称取10 g筛选后的黑糙米,经1.2.1预处理后,在避光条件下,设定超声功率为144 W,超声温度为45 ℃,单次循环喷雾加湿量为10 mL,间隔时间为5 min,分别在超声时间为30、45、60、75、90、105、120 min时对黑糙米进行发芽前处理,并经1.2.2处理后,考察不同超声时间对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响。

1.2.3.3 超声温度的选择 准确称取10 g筛选后的黑糙米,经1.2.1预处理后,在避光条件下,设定超声功率为144 W,超声时间为45 min,单次循环喷雾加湿量为10 mL,间隔时间为5 min,分别在超声温度为25、30、35、40、45、50 ℃时对黑糙米进行发芽前处理,并经1.2.2处理后,考察不同超声温度为对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响。

1.2.3.4 单次循环喷雾加湿量的选择 准确称取10 g筛选后的黑糙米,经1.2.1预处理后,在避光条件下,设定超声功率为144 W,超声时间为45 min,超声温度为40 ℃,间隔时间为5 min,分别在单次循环喷雾加湿量为5、10、15、20、25、30 mL时对黑糙米进行发芽前处理,并经1.2.2处理后,考察不同单次循环喷雾加湿量对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响。

1.2.3.5 间隔时间的选择 准确称取10 g筛选后的黑糙米,经1.2.1预处理后,在避光条件下,设定超声功率为144 W,超声时间为45 min,超声温度为40 ℃,单次循环喷雾加湿量为10 mL,分别在间隔时间为2.5、3.0、5.0、7.5、9.0、15.0 min时对黑糙米进行发芽前处理,并经1.2.2处理后,考察不同间隔时间对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响。

1.2.4 响应面优化试验设计 在单因素实验的基础上,结合Box-Behnken中心组合试验设计原理,以发芽黑糙米GABA含量和多酚含量为响应值,选取对富集发芽黑糙米生物活性物质影响较明显的超声温度、超声时间、单次循环喷雾加湿量3个因素,对工艺条件进行3因素3水平的响应面分析试验设计,优化超声波辅助喷雾加湿法富集发芽黑糙米生物活性物质工艺参数。响应面分析因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.2.5 发芽黑糙米GABA含量的测定 参考刘振春等[22]、张袆等[16]的方法略作改动。准确称取发芽黑糙米粉1 g,加20 mL 60%乙醇溶液,充分混匀后,在超声功率245 W,超声温度51 ℃下浸提20 min,将提取液于27 ℃下以4000 r/min离心10 min,取上清液待测。

GABA含量测定的具体操作步骤参考卓玛次力等[23]的方法。以γ-氨基丁酸为标准品,绘制标准曲线,得到回归线性方程y=0.0494x-0.0519(R2=0.9998),γ-氨基丁酸在0.01～0.50 mg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。GABA含量以每百克干样品中γ-氨基丁酸当量表示(mg/100 g)。

1.2.6 发芽黑糙米多酚含量的测定 参考陆俊等[24]的方法略作改动。准确称取发芽黑糙米粉1 g,并加入20 mL 60%的含有0.1%盐酸的乙醇溶液,充分混匀后,在超声功率500 W,超声温度35 ℃下浸提45 min,沉淀加提取液重复上述操作,合并提取液,并将提取液在27 ℃条件下以4000 r/min离心10 min,取上清液待测。

多酚含量测定的具体操作步骤参考Bursal等[25]的方法。以没食子酸为标准品,绘制标准曲线,得到回归线性方程y=0.0307x-0.033(R2=0.9992),没食子酸在0.015～0.100 mg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。多酚含量以每百克干样品中没食子酸当量表示(mg/100 g)。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 超声功率对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响 由图1可知,当超声功率为144 W时,发芽黑糙米GABA和多酚含量均显著高于其他功率范围(P<0.05),达到最大值,分别为79.62、307.24 mg/100 g,表明在此超声功率条件下有利于发芽黑糙米GABA和多酚物质的富集;随着超声功率的继续增大,发芽黑糙米GABA和多酚含量均逐渐降低且趋于平稳,表明高功率的超声波处理不利于发芽黑糙米GABA和多酚含量的富集,可能是因为在超声波处理过程中,随着超声功率的不断增强,声波的机械和化学作用破坏了黑糙米的细胞结构,促使其细胞内含物释放,又因GABA和多酚组分均易溶于水,导致其本身含有的GABA和多酚物质流失,进而影响发芽后黑糙米中生物活性成分的富集,也可能是因为较大的超声功率会使发芽黑糙米的GABA和多酚组分发生降解,进而造成GABA和多酚物质含量的降低[16,26],且不同超声功率之间差异不显著(P>0.05)。因此,选择最佳超声功率144 W进行后续优化试验。

图1 超声功率对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power on GABA content and polyphenol yield 注:同一指标的不同小写字母表示差异显著(P<0.05);图2～图5同。

2.1.2 超声时间对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响 由图2可知,随着超声时间的延长,发芽黑糙米GABA含量逐渐降低,当超声时间在45～60 min范围内时,发芽黑糙米GABA含量显著高于30、75、90、105和120 min时的GABA含量(P<0.05),可能是因为在此时间段大量内源酶被快速激活,使得催化生成的GABA含量增加,同时也表明在此超声时间范围内有利于发芽黑糙米GABA含量的富集,随后继续延长超声时间,发芽黑糙米GABA含量呈逐渐降低的趋势,可能是因为超声时间的逐渐延长导致部分GABA发生降解,使得GABA含量降低[27]。不同超声时间对发芽黑糙米多酚含量有显著性影响(P<0.05),当超声时间在30～60 min范围内时,发芽黑糙米多酚含量显著高于其他受试范围的多酚含量(P<0.05),随后继续延长超声时间,发芽黑糙米多酚含量呈急剧降低的趋势,可能是因为在较长超声时间的作用下,部分多酚被分解或者发生氧化反应,使得多酚含量降低,同时也表明长时间超声处理不利于原料中多酚物质的富集[28-29]。因此,综合考虑,将超声时间的范围确定在30～60 min进行后续响应面优化试验。

图2 超声时间对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响Fig.2 Effects of ultrasonic time on GABA content and polyphenol yield

2.1.3 超声温度对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响 由图3可知,超声温度对发芽黑糙米GABA和多酚含量有显著性影响(P<0.05)。当超声温度在25～40 ℃范围内时,发芽黑糙米GABA含量随着超声温度的升高先急剧增大后趋于平稳,当超声温度为40 ℃时,发芽黑糙米GABA含量达到最大值,随着超声温度继续升高,GABA含量呈降低趋势,这是因为在适当的温度范围内会有效激活用于生成GABA的谷氨酸脱羧酶的活性,进而促进GABA含量的积累,而当超声温度过高,导致谷氨酸脱羧酶的活性降低甚至丧失活性,从而影响GABA含量的富集[30]。当超声温度为40 ℃时,发芽黑糙米多酚含量显著高于其他受试温度范围(P<0.05),达到最大值423.56 mg/100 g,当超声温度继续升高时,发芽黑糙米多酚含量急剧降低,可能是因为高温会导致多酚组分结构被破坏,使其稳定性发生变化,进而影响多酚含量的富集[31]。因此,综合考虑,选择超声温度范围为35～45 ℃进行后续响应面优化试验。

图3 超声温度对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on GABA content and polyphenol yield

图4 单次循环喷雾加湿量对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响Fig.4 Effect of the amount of single-pass cycle spray humidification on GABA content and polyphenol yield

2.1.4 单次循环喷雾加湿量对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响 由图4可知,当单次循环喷雾加湿量在5～10 mL范围内时,发芽黑糙米GABA含量随着单次循环喷雾加湿量的增大而显著升高(P<0.05),当单次循环喷雾加湿量为10 mL时,GABA含量达到最大值,此后持续增大单次循环喷雾加湿量,发芽黑糙米GABA含量呈不断降低的趋势,这可能是因为循环加湿易使糙米内源酶活性被激活,进而促进GABA的生成,但因GABA易溶于水,当在超声波能量的作用下并不断增大单次循环喷雾加湿量会导致部分GABA流失,使得GABA含量降低;也可能是过大的单次循环喷雾加湿量会使糙米产生应力裂纹,从而影响其生命活动,不利于GABA含量的积累[32]。单次循环喷雾加湿量对发芽黑糙米多酚含量有显著性影响(P<0.05),当单次循环喷雾加湿量为10 mL时,发芽黑糙米多酚含量显著高于单次循环喷雾加湿量为5、15、20、25和30 mL 时的多酚含量(P<0.05),随后当单次循环喷雾加湿量继续增大时,发芽黑糙米多酚含量呈急剧降低的趋势,表明单次循环喷雾加湿量的持续增大不利于多酚组分的富集,且不同单次循环喷雾加湿量之间的差异显著(P<0.05)。因此,综合考虑,选择单次循环喷雾加湿量范围为5～15 mL进行后续响应面优化试验。

2.1.5 间隔时间对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响 由图5可知,当间隔时间在3～5 min范围内时,发芽黑糙米GABA含量之间差异不明显(P>0.05),但此范围GABA值显著高于其他间隔时间段(P<0.05),当间隔时间为5 min时,发芽黑糙米多酚含量显著高于其他间隔时间段(P<0.05),达到最大值,为423.56 mg/100 g;此后继续增大间隔时间,发芽黑糙米GABA和多酚含量均呈降低趋势,可能是因为间隔时间太短,会使糙米在发芽前产生应力裂纹,不利于GABA含量的富集,同时也会影响多酚含量积累,而间隔时间太长,可能会导致糙米中营养物质部分被消耗,多酚组分和已生成的GABA发生分解,且生成速率小于分解速率,进而影响多酚和GABA的积累[12,32],且不同间隔时间段之间差异不显著(P>0.05)。因此,选择最佳间隔时间5.0 min进行后续优化试验。

表3 GABA含量的回归方程方差分析Table 3 Analysis and statistical parameters of regression model of GABA contents

图5 间隔时间对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响Fig.5 Effect of interval time on GABA content and polyphenol yield

2.2 发芽黑糙米生物活性物质富集的响应面优化试验

2.2.1 响应模型的建立与分析 利用Design-Expert 7.0软件对表2试验数据进行二次多项式回归拟合,得到GABA和多酚含量对超声时间(A)、超声温度(B)、单次循环喷雾加湿量(C)的回归模型方程为:

GABA含量(mg/100 g)=85.27-2.31A+0.61B-5.77C+2.34AB+1.27AC+1.13BC-9.07A2-7.63B2-5.8C2

多酚含量(mg/100 g)=417.29-36.48A+6.24B-69.65C+0.82AB+12.96AC+1.84BC-76.72A2-45.63B2-63.07C2

表2 响应面分析方案及结果Table 2 Response surface methodology and analysis results

表4 多酚含量的回归方程方差分析Table 4 Analysis and statistical parameters of regression model of polyphenol yield

2.2.2 响应面图分析与优化 响应面图分析是在合理的实验设计的基础上,利用响应曲面的变化情况和等高线的稀疏程度,确定最佳工艺条件,同时可直观地评价各因素之间的交互作用[33-34]。该试验中通过观察图6、图7中响应曲面和等高线的变化直观的反映了超声时间(A)、超声温度(B)、单次循环喷雾加湿量(C)之间的交互作用对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响,当等高线呈圆形时表示两因素交互作用不显著,而呈椭圆形或马鞍形时则表示两因素交互作用显著[28]。

由图6a、图7a可以看出,超声时间与超声温度对GABA含量影响的响应曲面坡度较为陡峭,且超声时间与超声温度对GABA含量影响的等高线呈椭圆形且曲线较为密集,而对多酚含量影响的等高线趋于圆形且曲线较为稀疏,表明超声时间和超声温度的交互效应对发芽黑糙米GABA含量的影响较为显著,对多酚含量的影响不显著,与方差分析结果相符。同时,GABA和多酚含量随超声温度的升高和超声时间的延长呈先升高后降低的趋势,且超声时间的变化曲面较超声温度的变化曲面更陡峭,说明超声时间对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响更明显。

图6 各因素交互作用对发芽黑糙米GABA含量影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of GABA content

由图6b、图7b可以看出,超声时间与单次循环喷雾加湿量对GABA和多酚含量影响的响应曲面坡度均较陡峭,其等高线均呈椭圆形且曲线密集,表明超声时间与单次循环喷雾加湿量的交互效应对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响显著,与方差分析结果相符。同时,GABA和多酚含量随超声时间的延长和单次循环喷雾加湿量的增大呈先升高后降低的趋势,且单次循环喷雾加湿量的变化曲面较超声时间的变化曲面更陡峭,说明单次循环喷雾加湿量对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响更显著。

由图6c、图7c可以看出,单次循环喷雾加湿量与超声温度对GABA含量影响的响应曲面坡度较为陡峭,而对多酚含量影响的响应曲面坡度较为平缓,但其等高线均呈椭圆形且曲线较为密集,表明单次循环喷雾加湿量与超声温度的交互效应对发芽黑糙米GABA含量的影响显著,而对多酚含量的影响不显著,与方差分析结果相符。同时,GABA和多酚含量随超声温度的升高和单次循环喷雾加湿量的增大呈先升高后缓慢降低的趋势,且单次循环喷雾加湿量的变化曲面较超声温度的变化曲面更陡峭,说明单次循环喷雾加湿量对发芽黑糙米GABA和多酚含量的影响较为显著。

2.2.3 最佳条件的确定和回归模型的验证 通过响应面优化试验得到超声波辅助喷雾加湿法制备发芽黑糙米最佳工艺条件为:超声时间为46.4 min,超声温度为40.45 ℃,单次循环喷雾加湿量为10.94 mL,在此条件下得到的发芽黑糙米GABA含量为85.66 mg/100 g,发芽黑糙米多酚含量为427.56 mg/100 g。实际试验操作中稍作调整确定的最佳工艺条件为:超声时间为45 min,超声温度为40 ℃,单次循环喷雾加湿量为10 mL,在此条件下得到的发芽黑糙米GABA含量为83.71 mg/100 g,发芽黑糙米多酚含量为419.55 mg/100 g,与理论值较为接近。

图7 各因素交互作用对发芽黑糙米多酚含量影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of polyphenal yield

3 结论

在超声波辅助喷雾加湿法富集发芽黑糙米生物活性物质的单因素试验基础上,利用Box-Behnken响应面优化试验设计,通过Design-Expert 7.0软件对试验数据进行拟合和相关性分析,确定超声波辅助喷雾加湿法富集发芽黑糙米生物活性物质的最佳工艺参数为:超声功率144 W、超声温度40 ℃、超声时间45 min、单次循环喷雾加湿量10 mL、间隔时间5 min。在此条件下,发芽黑糙米GABA含量为83.71 mg/100 g,发芽黑糙米多酚含量为419.55 mg/100 g,表明该响应面试验优化的工艺条件具有实际的指导意义,有利于发芽黑糙米进一步的深入研究和相关产品的开发。