野生亚侧耳多糖的提取和对巨噬细胞Raw264.7的免疫调节作用研究

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(1.湖北文理学院食品科学技术学院·化学工程学院,湖北襄阳 441000;2.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163000)

亚侧耳(Hohenbueheliaserotina),又名冬蘑、元蘑、剥茸[1],属于真菌门亚侧耳属,主要分布在黑龙江和吉林的山区林区等地。作为黑龙江山珍特产之一,元蘑味道鲜美,含有蛋白质、糖类、多酚及黄酮等多种营养物质[2],深受人们喜爱。研究发现,亚侧耳多酚能明显抑制HeLa细胞的体外增殖[3],而亚侧耳分离得到的27 kDa核糖核酸酶(RNase)也被证明能够抑制人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)逆转录酶和减少MBL2淋巴瘤细胞的生成[4]。目前元蘑现代化食品十分丰富,有元蘑膨化食品、元蘑营养粥和元蘑运动饮料等[5-7]。

多糖是多个单糖以糖苷键连接组成的聚合高分子碳水化合物[8],普遍具有免疫调节作用[9-11]。现代医学研究发现,真菌多糖拥有抗癌、抗肿瘤等免疫作用[12-13]。熊川等[14]用水溶性灵芝子实体多糖刺激RAW264.7细胞后,发现试验细胞的吞噬能力及细胞因子分泌量均得到提高。现有关于亚侧耳多糖的报道普遍集中在亚侧耳多糖的抗肿瘤、抗氧化、防辐射等方面[15-17],然而其对小鼠巨噬细胞RAW264.7的免疫活性研究不多见。本文以Raw264.7细胞为细胞模型,探讨亚侧耳水溶性多糖对巨噬细胞的体外免疫调节作用,为亚侧耳多糖产品的合理开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

亚侧耳 伊春市松源山特产品有限责任公司;苯酚 福晨化学试剂厂;氢氧化钠 永大化学试剂有限公司;无水乙醇、硫酸、丙酮 西陇科学股份有限公司;葡萄糖标准品、福林酚乙液 索莱宝科技有限公司;RPMI-1640 培养基(含胎牛血清) 美国Gibco公司;水溶性四唑盐(WST-1) 瑞士Roche公司;Raw264.7细胞 美国标准生物品收藏中心(ATCC)。

FA2004N型分析天平(精确值0.0001 g) 上海精密仪器仪表有限公司;R200-旋转蒸发器 瑞士BUCHI公司;EL-800酶联检测仪 美国BioTek公司;722S分光光度计 上海精密仪器科学有限公司;SF-TDL-5A低俗离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司;数显恒温水浴锅 诺基仪器有限公司;SY-2000A旋转蒸发器 贤德实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 亚侧耳多糖的提取及糖含量测定

1.2.1.1 亚侧耳的预处理 将选购的野生亚侧耳去杂,然后进行鼓风干燥(75 ℃)12 h,烘干至符合打磨标准后粉碎,过100目筛后置于干燥器中备用。

1.2.1.2 亚侧耳多糖的提取和纯化 根据前期研究[18-19],结合所选原料特性后制定提取纯化方案。为了去除色素及小分子物质,先将50 g干燥的亚侧耳子实体粉末与500 mL浓度为80%的乙醇溶液充分混合,室温条件下搅拌3 h后,静置过夜。将混合液在4000 r/min条件下离心10 min(以下提取纯化操作过程中离心条件相同)后取沉淀,加入蒸馏水混匀(料液比为1∶10 g/mL)。置于水浴锅中,在100 ℃条件下水浴3 h后再次离心,取上清液。然后将溶液在65 ℃条件下经减压浓缩至原体积的1/5。向浓缩液中缓慢滴加4倍体积的无水乙醇并充分混合,冰箱中4 ℃静置一夜。经离心弃上清后50 ℃下干燥12 h,得到亚侧耳粗多糖。

将上述粗品用蒸馏水复溶(亚侧耳粗多糖与水的质量比为1∶10),40%乙醇再次沉淀。50 ℃温度下干燥12 h,得到亚侧耳多糖(HSP)。

1.2.1.3 亚侧耳多糖溶液中多糖含量的测定 参考改进的硫酸-苯酚法测定亚侧耳多糖中的多糖含量[20]。绘制标准曲线。准确称取无水葡萄糖标准品0.025 g于250 mL容量瓶中,加蒸馏水定容到刻度线。分别取标准液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL至干燥的试管中,每管补充蒸馏水至2.0 mL。分别向试管中添加0.5 mL 5%的苯酚溶液和5 mL的浓硫酸后冷却至室温,测定其在490 nm处的吸光度。

将0.01 g HSP粉末溶于100 mL蒸馏水中。吸取2.0 mL于试管中,加入1.0 mL 5%的苯酚溶液后,迅速加入5 mL浓硫酸,混匀后静置至室温。以蒸馏水反应物作对照,在490 nm处测定吸光度(每组设置3个平行,数值使用平均值)。

1.2.2 亚侧耳多糖对巨噬细胞Raw264.7的免疫调节作用

1.2.2.1 亚侧耳多糖对小鼠巨噬细胞的增殖作用 将巨噬细胞Raw264.7(100 μL,1×105cell/mL)和浓度分别为12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL的多糖溶液(100 μL)放置于96孔培养板中,空白对照加等量的生理盐水。以RPMI-1640(含10%胎牛血清)为培养基的,在37 ℃、5%CO2、95%空气条件下培养72 h,405 nm下测吸光度。增殖作用采用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒测定,结果以免疫细胞增殖率表示，计算公式如下:

式(1)

式中:As:实验组OD值;Ac:空白对照组OD值。

1.2.2.2 亚侧耳多糖对巨噬细胞NO分泌量的影响 将细胞浓度为1×106cell/mL的巨噬细胞(对数生长期)到96孔培养板中,(5% CO2、95%空气、37 ℃)培养24 h至细胞贴壁后,弃上清。目前在免疫细胞实验中普遍以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作为阳性对照[21-22]。以PBS(磷酸缓冲盐溶液)作为空白对照组、1 μg/mL LPS作为阳性对照组、HSP组的浓度分别为0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL(每孔100 μL)。继续培养24 h后取细胞培养上清液(100 μL),与等体积的Griess试剂混合,避光反应10 min,再用酶标仪在540 nm处测吸收值。NO浓度参考NaNO2(1～200 μmol/L)标准曲线计算，标准曲线公式为：y=0.0107x+0.0673,R2=0.9997。

1.2.2.3 亚侧耳多糖对巨噬细胞的细胞因子释放的影响 对RAW264.7巨噬细胞(对数生长期)进行传代处理,配成细胞浓度为1×106cell/mL的细胞悬液置于24孔培养孔中。以1 μg/mL的LPS作为阳性对照,生理盐水作为空白对照,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试验组中添加的多糖浓度梯度为0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL。

表1 引物名称及序列Table 1 Primers name and sequence

为了得到良好的线性关系,白细胞介素(interleukin,IL)-1β因子和前列腺素E2(prostaglandins E2,PGE2)的试验组选择25 μg/mL浓度以下的浓度进行试验,各梯度浓度分别为0、3.125、6.250、12.500、25.000 μg/mL。每个多糖处理组均设3个复孔,以上添加计量均为100 mL。在37 ℃、5% CO2、95%空气条件下培养48 h。用ELISA试剂盒检测细胞上清液中的细胞因子的表达量。

1.2.2.4 多糖对巨噬细胞免疫因子基因表达的影响(反转录-聚合酶链式反应) HSP(0、12.50、25.00、50.00 μg/mL)或LPS(1 μg/mL)存在下的巨噬细胞Raw264.7(1×106cell/mL),在24孔细胞培养板上37 ℃、5%CO2、95%空气条件下培养18 h。收集细胞,用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取总RNA,-80 ℃保存备用。以提取的RNA(2 μg)为模板,用oligo-(dT)20primer和Superscript III RT(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)制备cDNA,采用Go Taq Flexi DNA 聚合酶(Promega Madison)和PCR引物(表1)用PCR技术进行扩增。PCR扩增条件:预变性(94 ℃,3 min),进行重复变性(94 ℃,30 s),退火(56 ℃,40 s)和延伸(72 ℃,1 min)30次,保温(72 ℃,10 min)。染色后的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,用凝胶图像分析软件进行扫描和分析(Kodak Digital Science,Kennesaw,GA,USA)。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 亚侧耳多糖中的糖含量

以葡萄糖浓度(x)为横坐标,吸光度(y)为纵坐标,绘制标准曲线如图1。经公式计算得到HSP溶液的糖含量为(85.176±1.47) μg/mL,HSP粉末糖含量为85.18%。由于试验制备得到的HSP并不是由单一的葡萄糖组成,而是一种多糖复合物,因此需对亚侧耳多糖进行成分分析后,再进一步测定糖含量。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

2.2 亚侧耳多糖对巨噬细胞的增殖作用

巨噬细胞作为参与免疫系统调节的免疫效应细胞,其功能正常与否直接或间接关系到免疫应答过程中的抗原呈递和抗原清除能力[23]。LPS能够刺激小鼠巨噬细胞Raw264.7释放细胞因子,因此通常以此作为测定某种成分对免疫系统是否具有调节活性的阳性对照。不同浓度的HSP对巨噬细胞增殖活性的影响如图2a所示。在添加浓度为12.5 μg/mL HSP培育24 h后,Raw264.7细胞的增殖率明显升高。并且在12.5～100 μg/mL范围内,巨噬细胞Raw264.7的增殖率随HSP剂量的增加而增加(P<0.05),呈剂量依赖关系,且对Raw264.7无细胞毒害作用。添加HSP(1～100 μg/mL)的培养基颜色清澈,细胞透亮,长势良好,见图2b、图2c。

图2 HSP对巨噬细胞Raw264.7增殖率的影响Fig.2 Effect of HSP on cell proliferation of Raw264.7 cells注:a:不同字母表明组间的显著性差异(P<0.05),图3～图7同;b:试验前细胞形态图;c:100.00 μg/mL HSP培育24 h后细胞形态图。

2.3 亚侧耳多糖对巨噬细胞NO分泌量的影响

NO分泌水平是巨噬细胞激活的一个重要指标[24]。巨噬细胞受刺激产生的NO能够协同机体对抗外来抗原,影响抗肿瘤、抗病毒和抑制胞内病原体增殖等免疫活性[25]。试验细胞中NO释放量的变化如图3,NO的分泌量与HSP剂量呈现正相关,有剂量依赖关系。HSP低剂量组(12.5 μg/mL)与空白组(无HSP添加)相比,NO生成量显著提高(P<0.05)。HSP在浓度为100 μg/mL时,Raw264.7巨噬细胞分泌NO的量为29.94 μmol/L,与LPS阳性对照组在Raw264.7中生成NO(30.43 μmol/L)的量相接近,两组之间没有显著差异(P>0.05)。试验中HSP显著增加了巨噬细胞释放NO的能力,可以认定为HSP是巨噬细胞免疫调节物质,具有免疫调节活性。

图3 HSP对巨噬细胞Raw264.7中NO的影响Fig.3 Effect of HSP on NO production in macrophage Raw264.7 cells

2.4 亚侧耳多糖对巨噬细胞的细胞因子释放的影响

真菌多糖可以通过活化效应巨噬细胞而释放细胞因子,从而调控机体免疫系统及免疫通路[26]。其中,TNF-α是自身免疫性疾病中重要的炎症介质,能够激活T细胞,并诱导中性粒细胞聚集,刺激吞噬行为的产生[27-28]。如图4所示,与亚侧耳多糖浓度为0的空白组相比较,不同含量的多糖组分均能够刺激巨噬细胞释放细胞因子TNF-α的活性。TNF-α的分泌量同HSP浓度呈正相关,但是随HSP浓度的增加,分泌量递增速度减慢。HSP以100 μg/mL的浓度处理Raw264.7细胞后,TNF-α含量为14.344 ng/mL,与LPS组相接近,说明HSP对TNF-α的分泌有促进作用。

图4 HSP对巨噬细胞中TNF-α释放的影响Fig.4 Effect of HSP on TNF-α release in macrophages

IL-1β是一种能够活化巨噬细胞,并参与抗体产生的免疫因子。图5为HSP作用下的巨噬细胞IL-1β表达量的变化,添加HSP或LPS后较空白组的IL-1β分泌量都极显著升高(P<0.05)。在韩真[29]的实验中,使用200 μg/mL的蜜环菌葡聚糖溶液刺激RAW264.7巨噬细胞后,IL-1β含量达到空白组的1.5倍。而在本试验中,低剂量添加组(3.125 μg/mL)的IL-1β分泌量与空白组相比较,达到其4倍之多。在25.000 μg/mL HSP作用浓度下刺激RAW264.7免疫细胞产生的IL-1β分泌量(31.9524 pg/mL,)与1 μg/mL LPS阳性对照组分泌量(31.8793 pg/mL),无显著性差异(P>0.05),表明HSP对IL-1β的释放具有正向促进作用。

图5 HSP对巨噬细胞中IL-1β释放的影响Fig.5 Effect of HSP on IL-1β release in macrophages

PGE2是广泛存在于有机体内的一种前列腺素类物质。在维持体内环境及炎症调节方面,PGE2能够有效与不同受体结合并发挥相关作用[30]。HSP对PGE-2的影响结果如图6所示,在3.125～25.000 μg/mL浓度范围内,HSP能够促进PGE-2细胞因子的分泌,并且存在浓度依赖性关系。在前期研究[24]中,使用真姬菇多糖提取物刺激巨噬细胞后,PGE2分泌量受添加真姬菇多糖提取物浓度影响,这与本试验结果相似。但真姬菇多糖溶液的添加浓度在100 μg/mL时PGE2分泌量才与阳性对照组相接近,而25 μg/mL HSP刺激产生的PGE2量(1.8174 ng/mL)接近LPS阳性对照组(1.9227 ng/mL),证明HSP对PGE2有较强的刺激作用。

图6 HSP对巨噬细胞中PGE2释放的影响Fig.6 Effect of HSP on PGE2 release in macrophages

巨噬细胞的吞噬能力可直接或间接的体现其免疫应答能力。试验中PEG2、IL-1β和TNF-α三种细胞因子分泌量的变化表明,HSP能够通过促进免疫因子的产生,从而提高Raw264.7细胞的免疫防御能力。

图7 各免疫因子mRNA的RT-qPCR水平Fig.7 RT-qPCR levels of mRNA of immune factors

2.5 多糖对巨噬细胞免疫因子转录水平表达的影响

4 结论

研究发现亚侧耳水溶性多糖在体外细胞实验中表现出较强的免疫活性和低细胞毒性。HSP能够促进Raw264.7巨噬细胞中NO、PGE2、COX-2、IL-6、iNOS、TNF-α和IL-1β等细胞因子的释放。此外HSP也能够有效提高iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达量。因此HSP可以作为天然免疫调节剂应用到食品及药品领域中,具有广阔的研究和应用前景。今后,我们将会对HSP多糖的免疫活性机理及其构效关系进行进一步的深入研究。