miR-214-5p 靶向PAK4对缺血再灌注大鼠的心肌损伤和免疫反应的调节作用

杨曦艳， 关晓楠， 赵文淑△， 刘 杰， 赵 亮, 杨 迪

(1首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心， 2北京市高血压重点实验室， 北京 100020)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌血流恢复再灌注造成新陈代谢功能障碍以及加重心肌细胞的结构性损伤而导致细胞死亡以及梗死扩大[1]，是冠状动脉旁路移植术再灌注治疗、冠状动脉溶栓以及经皮冠状动脉介入治疗过程中发生的并发症[2]，加速了心脑血管疾病的发生率和死亡率。因此，如何有效减轻MIRI是一个亟待解决的问题。微小RNA(microRNA，miRNA)被认为是心血管疾病的关键调控因子，包括心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚和心律失常等等[3]。因此，miRNA可能是MIRI的有效治疗靶点。已有研究表明miR-214缺乏可导致严重的MIRI，促进纤维化进程以及心肌细胞凋亡[4]，因此，miR-214有望成为有效治疗MIRI的靶点。miR-214-5p是miR-214从5’端的臂加工而来，可靶向p21活化蛋白激酶4(p21-activated protein kinase 4, PAK4),而PAK4是一类保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过对下游底物的磷酸化来参与并调节细胞增殖、分化、细胞骨架重构以及细胞凋亡等众多细胞重要过程[5]。本项工作应用大鼠MIRI模型，探讨miR-214-5p 靶向PAK4对缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)大鼠心肌损伤和免疫反应的作用。

材 料 和 方 法

1 动物

36只体重为(200±10) g 的SPF 级健康雄性 SD 大鼠，购自北京市医疗器械检验所，许可证号：SYXK(京)2015-0005。实验动物在温度(24±2) ℃ 左右、湿度50% 左右，光照为12/12 h光-暗的动物饲养室饲养，在实验前适应性喂养1周。

2 主要试剂

心肌细胞购自ATCC(编号：ATCC-0006)。miR-214-5p过表达腺病毒(Ad-miR-214-5p)和对照腺病毒(Ad-Scramble)购自上海吉凯基因化学技术有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒购自江莱生物科研试剂有限公司(货号：TO1061);丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒购自上海晨易生物科技有限公司(货号：1306-06-5);大鼠心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、肌红蛋白(myoglobin,Mb)、白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factr-α, TNF-α) ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(货号：ml003145、ml059533、ml003054、ml102828、ml003057和ml002859);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒购自上海晶康生物工程有限公司(货号：JLC-SJ2508-250T)。

3 主要方法

3.1分组、体内基因转移及MIRI大鼠构建[6]将大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(I/R组)、腺病毒对照组(Ad-Scramble组)和miR-214-5p过表达组(Ad-miR-214-5p组)，每组9只；腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥麻醉大鼠，在左胸第4和第5肋骨切口，轻轻打开心包以暴露心脏。通过26号针头分别将100 μL 的Ad-miR-214-5p(1×109PFU)、Ad Scramble(1×109PFU)或盐水溶液注入对应各组大鼠左心室前壁6个不同的位点， 缝合胸腔，让大鼠恢复。4 d后，将所有大鼠再次麻醉，重新打开胸腔，使用6-0丝线缝合左前部下行冠状动脉(left anterior descending coronary artery, LAD)，将1.5 mm医用乳胶管放置在结扎线和LAD之间。通过收紧乳胶管周围的结扎诱导心肌缺血，在缺血30 min后，取出乳胶管以恢复冠状动脉循环。在再灌注后12 h，获得心脏和血液样品用于进一步分析。假手术组除LAD未结扎之外，进行相同的程序。

3.2RT-qPCR检测miR-214表达水平 用TRIzol法提取总RNA并试剂盒说明逆转录为cDNA，进行real-time PCR检测。反应条件：94 ℃预变性30 s; 94 ℃变性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环。β-actin作为内参照，应用凝胶成像系统(Bio-Rad)摄影，Quantity One 软件进行扫描分析，计算采用2-ΔΔCt法。miR-214的上游引物序列为 5’-TGCGGACAGCAGGCACAGAC-3’，下游引物序列为 5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；内参照U6的上游引物序列为 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA- 3’,下游引物序列为 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

3.3HE染色观察心肌损伤 将组织用甲醛固定后，用乙醇梯度脱水，再用二甲苯透明，用石蜡包埋切片；接着，用二甲苯脱蜡，乙醇至水；然后用苏木精水溶液染色、乙醇脱水、伊红染色液染色；乙醇脱水、二甲苯透明，封片观察。

3.4ELISA检测心肌损伤标志物、炎症因子及活性氧水平 将样品加入各反应孔，37 ℃反应45 min。接着用洗涤液洗涤 4 次，再加入生物素标记的抗体，在 37 ℃孵育30 min。洗涤后加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的链霉亲和素混合均匀， 在37 ℃反应 30 min，接着加入显色剂避光显色，最后加终止液终止反应，检测结果。

3.5氧化应激的检测 将心肌组织在冰上研磨制成 10% 组织匀浆装于离心管，离心取上清液。用考马斯亮蓝法检测上清液中蛋白质含量，再按试剂盒使用说明操作进行SOD和MDA的测定。

3.6流式细胞术检测细胞凋亡 加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，离心弃上清，收集细胞，加入195 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。200×g离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，进行流式细胞仪检测。

3.7靶基因预测 应用基因预测软件TargetScan (http://www.targetscan.org)预测miR-214-5p的靶基因。

3.8双萤光素酶报告基因实验检测靶向关系 收集生长至对数期的心肌细胞，铺于96孔板，每孔约4(103个细胞，24 h后，分别转染Ad-Scramble+PAK4 WT、Ad-Scramble+PAK4 MUT、Ad-miR-214-5p+PAK4 WT和Ad-miR-214-5p+PAK4 MUT，根据双萤光素酶报告基因试剂盒说明进行测定，用萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性比值表示萤光素酶的相对活性。

3.9Western Blot检测凋亡标志蛋白、PAK4、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)和磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)表达 用RIPA裂解液提取培养3 d的各组大鼠心肌细胞总蛋白，用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，10% SDS-PAGE分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至聚偏氟乙烯膜。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入对应的I抗于4℃封闭过夜，第2天加入对应II抗室温封闭1 h，最后用增强型化学发光法曝光。

4 统计学处理

用统计软件SPSS 21.0分析实验数据，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。均数之间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MIRI诱导心肌细胞中miR-214表达下调

再灌注12 h后， MIRI大鼠心肌细胞中miR-214表达较无损伤假手术组显著下调(P<0.01);与I/R组相比，Ad-Scramble组大鼠心肌细胞中miR-214表达无明显变化，Ad-miR-214-5p组大鼠心肌细胞中miR-214表达显著上调(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The expression level of miR-214 in myocardial cells was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图1 RT-qPCR检测各组细胞中miR-214的表达水平

2 miR-214-5p过表达减轻 MIRI引起的心肌组织损伤

Sham组大鼠心肌组织结构致密整齐，心肌纤维完整，无心肌纤维断裂；I/R组与Ad-Scramble组大鼠心肌组织出现细胞排列严重紊乱，大量心肌纤维断裂，细胞变性坏死严重；Ad-miR-214-5p组大鼠心肌组织出现细胞排列轻度紊乱，较少心肌纤维断裂，细胞变性坏死较轻，见图2A。与sham组相比，I/R组大鼠CK-MB、Mb和cTnI表达显著上调(P<0.01)；与I/R组相比，Ad-Scramble组大鼠CK-MB、Mb和cTnI表达无显著变化，Ad-miR-214-5p组大鼠CK-MB、Mb和cTnI表达显著下调(P<0.01)，见图2B。

3 miR-214-5p过表达减轻MIRI引起的心肌细胞凋亡

与sham组相比，I/R组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与I/R组相比，Ad-Scramble组大鼠心肌细胞凋亡率无显著变化，Ad-miR-214-5p组大鼠心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.01),见图3。

Figure 2.Myocardial injury in rats of each group. A: myocardial injury was observed by HE staining; B: myocardial injury marker protein expression was detected by ELISA. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图2 各组大鼠心肌损伤情况

Figure 3.Apoptosis detected by flow cytometry. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图3 通过流式细胞术检测细胞凋亡情况

与sham组相比，I/R组大鼠Bcl-2表达显著下调，Bax、caspase-3和caspase-9表达显著上调(P<0.01)；与I/R组相比，Ad-Scramble组大鼠Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9的表达无显著变化，Ad-miR-214-5p组大鼠Bcl-2表达显著上调,Bax、caspase-3和caspase-9表达显著下调(P<0.01),见图4。

4 miR-214-5p过表达减轻 MIRI引起的氧化应激

与sham组相比，I/R组大鼠SOD活性显著降低(P<0.01)，MDA含量显著增高(P<0.01)；与I/R组相比，Ad-Scramble组大鼠SOD活性和MDA含量无显著变化，Ad-miR-214-5p组大鼠SOD活性显著增高(P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.01),见图5。

5 miR-214-5p过表达减轻 MIRI引起的炎症反应

与sham组相比，I/R组大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α的含量显著升高(P<0.01)；与I/R组相比，Ad-Scramble组大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α的含量无显著变化，Ad-miR-214-5p组大鼠IL-6和IL-1β和TNF-α的含量显著降低(P<0.01),见图6。

6 miR-214-5p靶向调节PAK4

通过基因软件筛选出PAK4作为miR-214-5p 的靶基因，miR-214-5p与PAK4的3’-UTR存在结合位点,见图7A。双萤光素酶报告基因检测实验显示，miR-214-5p高表达明显抑制了含有野生型PAK4质粒的萤光素酶活性，但对突变型PAK4质粒的萤光素酶活性无影响(P<0.01)，见图7B。通过Western I/R组大鼠PAK4表达显著下调(Pblot检测PAK4的表达水平可知：与sham组相比，<0.01)； 与I/R组相比，Ad-Scramble组大鼠PAK4的表达无显著变化，Ad-miR-214-5p组大鼠PAK4表达显著上调(P<0.01)，见图7C。

Figure 4.The expression levels of caspase-9, caspase-3, Bax and Bcl-2 detected by Western blotting. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图4 Western blot检测caspase-9、caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平

7 miR-214-5p过表达激活 MIRI大鼠PI13K/Akt/ mTOR通路

与sham组相比，I/R组大鼠p-Akt和p-mTOR表达显著下调(P<0.01)；与I/R组相比，Ad-Scramble组大鼠p-Akt和p-mTOR的表达无显著变化，Ad-miR-214-5p组大鼠p-Akt和p-mTOR表达显著上调(P<0.01)，见图8。

讨 论

miRNA是一类小的非编码RNA，通过转录或转录后调控靶基因的表达是在MIRI中起关键的调控作用，如miR-17-3p、miR-146b[5-7]等。已有研究表明miR-214缺乏可导致严重的MIRI，增加纤维化进程以及心肌细胞凋亡[8]，因此，预测作为从miR-214 5’端的臂加工而来的miR-214-5p过表达能够改善MIRI，并对其机制进行相关研究。

心肌组织损伤程度是MIRI最直观的衡量指标，而CK-MB、Mb和cTnI等是心肌梗死的辅助诊断指标。本实验结果显示，miR-214-5p过表达下调MIRI大鼠CK-MB、Mb和cTnI表达。而CK-MB、Mb和cTnI高表达意味着心肌受损程度的加深[9]，这提示miR-214-5p过表达减轻MIRI。本实验结果还显示，miR-214-5p过表达降低大鼠心肌细胞凋亡率，上调Bcl-2，下调Bax、caspase-3和caspase-9。Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，而Bax是与Bcl-2同源的水溶性相关蛋白，具有促进细胞凋亡的作用，二者都属于线粒体凋亡途径的标志蛋白[10]。caspase-3和caspase-9是半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶，是广泛运用的凋亡标志蛋白，而细胞凋亡途径主要有胞外信号激活细胞内的凋亡酶激活因子激活caspase和通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase途径[11]。因此，miR-214-5p过表达明显抑制MIRI大鼠心肌细胞依赖线粒体的凋亡途径。

Figure 5.Oxidative stress of cardiomyocytes in each group. A: SOD activity; B: MDA content. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图5 各组大鼠心肌细胞氧化应激情况

缺血时自由基的产生远远超出自身内源性抗氧化系统的清除能力，引起氧化应激反应[12]，而活性氧可以引起细胞的凋亡[13]，从而加剧心肌细胞的损伤程度。SOD和MDA是氧化应激的主要指标，已有研究表明MIRI会引起SOD活性降低,MDA含量增加[14]。本项检测显示miR-214-5p过表达升高MIRI大鼠的SOD活性,减少MDA含量，说明miR-214-5p过表达能减轻MIRI大鼠的氧化应激反应。同时，MIRI会引起炎症反应，而炎症反应会加重MIRI[15]。本实验结果显示miR-214-5p过表达显著降低MIRI大鼠IL-6，IL-1β和TNF-α的含量，这与已有研究抑制炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的释放可以减缓MIRI大鼠心肌细胞损伤结果相一致[16]，说明miR-214-5p过表达能够抑制MIRI引起的炎症反应。

Figure 6.The levels of inflammatory factors IL-6, IL-1β and TNF-α measured by ELISA. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图6 ELISA检测炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量

Figure 7.miR-214-5p targeted PAK4 and upregulated its expression. A:PAK4was predicted by gene software as a target gene of miR-214-5p; B: targeting relationship was detected by luciferase assay; C: the expression level of PAK4 was detected by Western blotting. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图7 miR-214-5p靶向上调PAK4

Figure 8.The protein levels of p-Akt and p-mTOR detected by Western blot. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图8 Western blot检测p-Akt和p-mTOR的表达水平

本项实验通过基因预测软件筛选出miR-214-5p与PAK4的3’-UTR存在结合位点，PAK4是miR-214-5p 的靶基因，且miR-214-5p靶向上调PAK4的表达。已有研究表明PAK4过表达上调p-Akt和p-mTOR表达，激活PI3K/Akt/mTOR通路[17]。而PI3K/Akt/mTOR通路是具有调节各种重要的细胞功能，如蛋白质合成、细胞增殖、细胞凋亡、存活等，其可通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用[18]。本文通过研究显示miR-214-5p过表达能够明显上调p-Akt和p-mTOR表达，激活PI3K/Akt/mTOR通路，这与已有研究MIRI会抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活相一致[19]。

综上所述，miR-214-5p过表达靶向PAK4减轻MIRI，并抑制心肌细胞凋亡、氧化应激反应和炎症反应，同时激活PI3K/Akt/mTOR通路。本实验为MIRI的靶向治疗提供实验参考数据，但其具体分子机制尚待深入研究。