棉铃虫鞣化激素β亚基参与脂肪组织免疫的相关功能基因表达模式

嵇玉洁，马星宇，宋永辉，杜孟芳，魏纪珍，尹新明，刘晓光，安世恒

(河南农业大学植物保护学院/省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室, 郑州 450002)

0 引 言

【研究意义】鞣化激素(Bursicon，burs)是一类天然异源二聚体多肽类激素，在昆虫及甲壳纲动物中普遍存在[1]。昆虫表皮发育及鞣化，需要在诸多激素及其受体参与的一系列信号通路协同下完成，其中鞣化激素作为该通路中的重要成员之一，还参与免疫等其它重要功能[1-2]。对棉铃虫鞣化激素β亚基(burs-β)及其表达的同聚体激素进行研究，为研究其参与幼虫生长发育提供理论基础，且对降低鳞翅目免疫及抗性、有效控制害虫，寻找新靶标基因具有重要意义。【前人研究进展】研究发现，α亚基(burs- )与β亚基组成的鞣化激素异源二聚体可以与其受体G蛋白偶联受体Rickets特异结合，迅速激活环腺苷/蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A, cAMP/PKA)信号通路，PKA进一步激活下游关键基因，参与昆虫生长发育[3-4]。2个亚基也可在体内形成α亚基或β亚基同源二聚体[2-3]。与其异源二聚体有所不同，鞣化激素同源二聚体以诱导体内某些抗菌肽基因的转录变化，参与免疫应答反应[4]。对颈部结扎的黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)注射重组burs-β，能引起一系列免疫反应相关基因的表达，并且所引起免疫反应的强度同注射重组蛋白的剂量和时间有关。将注射重组鞣化激素蛋白的虫体匀浆液，与革兰氏阴性菌Escherichiacoli共培养，发现能够显著抑制细菌的生长[4]。表皮鞣化是伴随着蜕皮而发生的。由于天敌的袭击或者简单的接触损伤都能对昆虫柔软表皮造成不同程度的伤害，抗菌肽强有力的防御作用是这个时期的昆虫所必需的。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是昆虫天然免疫系统的重要组成部分[5]。昆虫抗菌肽主要在脂肪细胞内合成，在上皮细胞、生殖道、马氏管和气管等也有表达，其感染病原菌后随即引起体内上皮细胞、脂肪体诱导表达抗菌肽，这些抗菌肽通过分泌到淋巴液中执行相关功能[6]。研究表明，burs介导角质层鞣化和翅的伸展[7-9]，引起鞣化途径中的cAMP/PKA信号传导途径和酪氨酸羟化酶活化[10]。在黑腹果蝇(D.melanogaster)中，2条不同的信号传导途径，即Toll和IMD(Immune deficiency)途径，负责病原体的识别和抗微生物免疫反应的激活[11]。burs通过激活转录因子的表达，通过IMD途径介导免疫反应[4]。Buchon 等及Dutta 等[12-14]分别通过体外细胞实验，分析果蝇中肠和人细胞特异性表达谱数，结果发现α亚基在成虫中肠内分泌细胞中表达，α亚基也可以与受体Rickets结合，引起cAMP的活性增加，而β亚基没有表达，可能β亚基在此过程中是非必须的。鞣化激素两种同源二聚体某些时候是以Rickets为直接受体结合，某些组织中似乎不是通过连接Rickets起作用的，该2种同源二聚体可能是经由未发现的新的受体来调控抗菌肽表达的[4]。【本研究切入点】刚蜕皮的棉铃虫表皮是柔软的(在表皮硬化和黑色素化之前)，并且更容易受到伤害和感染。此时可能由于微生物者或简单的接触伤害而在软角质层中出现穿孔，幼虫利用诱导抗菌防御措施，在此过程中，鞣化激素可能起着潜在的重要作用。研究棉铃虫鞣化激素β亚基参与脂肪组织免疫的相关功能基因表达模式。【拟解决的关键问题】以棉铃虫幼虫作为材料，利用生物分子技术，对棉铃虫鞣化激素β亚基基因及其表达的burs-β同聚体蛋白进行研究，为研究其参与幼虫生长发育提供理论基础，为降低鳞翅目免疫及抗性、有效控制害虫，寻找新的靶标基因提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试昆虫

棉铃虫为实验室人工饲养种群，饲养条件：温度(26±1)℃，相对湿度65%，光周期16 L∶8 D。

1.1.2 主要试剂与仪器

鞣化激素β亚基形成的同源二聚体(Bursicon-β，Burs-β)重组蛋白为实验室293T细胞真核表达。总RNA抽提试剂(Trizol Reagent)购自Invertrigen公司；反转录试剂盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)购自TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、限制性内切酶(BamHI、HandIII等)、pMD19-T载体、荧光定量试剂盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)；DNA凝胶回收试剂盒、产物纯化试剂盒和质粒提取试剂盒、IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)以及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)为上海生工生物公司产品；昆虫组织培养液(Grace’s Insect Medium，Gibco公司)；研究使用的其他试剂均为国产或进口分析纯。PCR仪(Mastercycle Pro S型PCR仪购自德国Eppendorf公司)，Real time PCR仪(ABI, Carlsbad,CA美国)，超低温离心机(Eppendorf德国Eppendorf)，紫外分光光度计(ND-2000,购自美国NanoDrop)，凝胶成像系统，恒温培养箱，恒温摇床等均为国产普通品牌。

1.2 方 法

1.2.1 组织样品获得及cDNA模板的合成

在显微镜下用剖镊解剖棉铃虫脂肪组织(约20头，3次重复)，立即置于Trizol试剂中，参照试剂盒说明，提取总RNA。将提取好的总RNA分别取1μL用NanoDropTM检测，记录各自浓度和RNA质量，保证OD260/OD280比值在1.8左右。将获得的各样品总RNA按照反转录试剂盒操作步骤合成cDNA: gDNA Eraser Buffer 2 μL, 1 μL gDNA Eraser, 1 μg不同样品总RNA, 6 μL RNase free dH2O，组成10 μL体系，42℃反应2 min，冰上加入5×PrimeScript®Buffer 2 μL, PrimeScript®RT Enzyme MixⅠ1 μL, RT Primer Mix 1 μL, RNase free H2O 4 μL。将以上混合均匀后37℃孵育15 min，然后85℃孵育5 s，样品在-80℃保存以备合成双链RNA使用。

1.2.2 鞣化激素β亚基基因的获得及dsRNA的合成

以前期获得的棉铃虫转录组unigene建立本地数据库，利用已知家蚕鞣化激素β亚基的氨基酸序列(GenBank:NP_001037289.1)，作为诱饵蛋白进行tBlastn搜索，钓取棉铃虫候选基因，获得棉铃虫该基因cDNA序列，设计引物，引物合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

以棉铃虫cDNA 为模板，根据棉铃虫鞣化激素β亚基和EGFP序列设计普通PCR扩增引物和含有 T7 启动子(斜体)序列的 RNAi 引物(表1)。合成方法参照姚雪等[15](2019)方法，首先用不含T7启动子的引物进行第一轮PCR扩增，电泳检测，将并PCR产物纯化，切胶回收后将待干扰基因Burs-β片段与pMD19-T载体连接，对照采用实验室保存的含有EGFP基因片段序列的表达载体pNUS-EGFPcH(质粒中EGFP的GenBank登录号AY056838)，通过蓝白斑筛选，经测序验证正确后备用。接下来分别以含有Burs-β与EGFP目的片段的pMD19- T质粒为模板，分别以含有T7启动子序列的Burs-β与EGFP引物进行PCR扩增，连接pMD-19T载体，通过蓝白斑筛选，经测序验证正确后作为模板，以含有T7启动子的引物进行PCR扩增，并纯化PCR产物，然后用 MEGA script RNAi Kit (ABI公司)进行体外转录，合成的Burs-β与EGFP dsRNA片段-20℃保存以备RNAi试验用。表1

表1 试验用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3Burs-β同聚体蛋白处理棉铃虫脂肪体引起相关免疫相关基因表达变化

根据获得的Burs-β基因cDNA序列(未发表)设计荧光定量引物；同时根据wang等棉铃虫相关免疫基因序列(cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin)，设计了荧光定量引物[17-18]。

取棉铃虫5龄48 h幼虫脂肪体组织，PBS清洗后放入组织培养液(Grace’s Insect Medium，Gibco公司)培养，将Burs-β同聚体重组蛋白处理体外培养的幼虫脂肪体组织，Burs-β重组蛋白用DMSO悬浮溶解(Burs-β重组蛋白终浓度30 μg/mg组织)，处理不同时间(0.5、1和3 h)，对照用DMSO处理相同时间后分别取样，将样品立即置于Trizol试剂中、并迅速用液氮冷冻，提取总RNA，反转录。以各样品cDNA为模版，以合成的qRT-PCR引物进行qRT-PCR检测，18S rRNA(GenBank: KT343378)作为内参基因。qRT-PCR反应体系10 μL: SYBRPremixExTaqTM(2×)5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板1 μL, 无RNA酶的双蒸水 4 μL。扩增条件: 95℃预变性3 min; 95℃变性15 s, 60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共计40个循环，各处理重复3次 。不同基因mRNA表达水平检测采用ABI7500 qRT-PCR仪(ABI，Carlsbad，CA，美国)，以18S rRNA(GenBank：KT343378)作为内参基因。利用2-△△Ct方法分析基因转录的差异，△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因；△△Ct=△Ct处理-△Ct参考基因[16]。 表1

1.2.4Burs-βdsRNA干涉后棉铃虫幼虫后免疫相关基因表达检测

玻璃毛细管拉长后固定在微量注射器末端，将合成的Burs-β双链RNA注射入5龄第1 d棉铃虫幼虫腹足，每头幼虫注射Burs-βdsRNA 30 μg，对照注射相同剂量的dsEGFP，分别在注射后24、48和72 h取脂肪体组织，每组注射10头，共3次重复，保存在400 mL Trizol中，立即用液氮冷冻后提取总RNA，反转录备用。根据棉铃虫免疫相关基因Cecropin1(GU182916.1)、cecropin2(GU182909.1)、cecropin3(GU182910.1)、attacin(AY948540.1)、cecropinD(EU041763.1)、gloverin(GU182908.1)、defensin(KT346374.1)、moricin(GU182911.1)和lebocin(KT346375.1)设计引物[17-18]。以各样品cDNA为模版，以合成的qRT-PCR引物进行qRT-PCR检测，PCR反应体系和方法同1.2.3，分析不同处理棉铃虫样品中免疫相关基因(cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin)mRNA转录水平。

1.3 数据处理

数据结果参照Yue等和Du等统计学分析方法[19-20]，即取3次生物学试验重复，误差计算3次重复的标准差；不同时间点两两间的差异显著采用独立样本t检验，不同数据间差异显著采用单因素方程分析，数据处理首先采用DPS软件(DPS7.05单机版)单因素方差分析(One-way analysis of variance, ANOVA)，接着进行LSD检验(Least Significant Difference)，P<0.001用“***”、P<0.01用“**”或大写字母，P<0.05用*或小写字母。

2 结果与分析

2.1 Burs- β同聚体蛋白处理棉铃虫脂肪体引起相关免疫相关基因表达变化

研究表明，幼虫脂肪组织经Burs-β同聚体蛋白处理后，免疫相关基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin随着时间的增加，转录水平具有相同的变化趋势，即0.5内转录水平迅速上升，随后在1后恢复至初始水平，在3内与初始转录水平亦无显著变化。图1

2.2 幼虫Burs- β dsRNA合成及注射棉铃虫后干扰效果检测

以棉铃虫cDNA 为模板，以棉铃虫Burs-β和EGFP普通PCR引物作为首轮扩增，测序正确后，以含有正确片段的质粒作为模板，以含有 T7 启动子序列的 RNAi 引物，进行PCR扩增，经测序验证正确后，利用 MEGA script RNAi Kit 试剂盒进行体外转录，合成Burs-β与EGFP dsRNA片段，将合成产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，Burs-β与EGFP dsRNA片段分别在质量在350 bp与520 bp ，与预测片段大小符合，dsRNA合成质量良好。

将合成好的Burs-β与EGFP dsRNA注射5龄幼虫腹足，在注射后24、48和72 h分别取脂肪体组织，利用qRT-PCR 的方法对干涉效果进行检测。qRT-PCR结果显示，注射Burs-βdsRNA后，在24 与48 h，干涉效果不明显，但在注射Burs-βdsRNA 72 h后，干涉效果极其显著，内源性Burs-β得到干涉。图2

图1Burs-β同聚体蛋白处理棉铃虫脂肪体引起相关免疫相关基因表达变化
Fig.1 Effect ofburs-βhomomer proteins on related immune genes transcript level of fat body tissue

M，DNA mark(DL2000), 1, dsEGFP, 2 dsP burs-β

图2 棉铃虫dsburs-β基因RCR检测结果
Fig.2 PCR product ofburs-βdsRNA gene

2.3 幼虫注射 Burs- β dsRNA对棉铃虫免疫相关基因转录水平的影响

棉铃虫5龄1对注射Burs-βdsRNA，72 h检测Burs-β干涉成功后，将注射后72 h作为研究免疫基因转录水平变化的检测点，对相应处理进行取样检测，分析棉铃虫免疫相关基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin在幼虫体内Burs-β下调时的表达情况。qRT-PCR结果显示，与对照转录水平相比，cecropin1在干涉后72 h显著降低(P=0.001 7)；免疫相关基因cecropin2在72 h后转录水平也有相应程度下调，与对照处理差异显著(P=0.040 5)；免疫基因cecropin3在72 h后与对照相比显著下调(P=0.008 8)；免疫基因attacin在72 h与对照相比差异显著(P=0.008 1)； 免疫基因cecropinD在72 h后转录水平与对照相比差异显著(P=0.048 3)；免疫基因gloverin在72 h后与对照相比下调显著，达到极显著差异(P=0.000 2)；免疫基因defensin在72 h后转录水平也有相应程度下调，与对照处理差异显著(P<0.004 9)；免疫基因moricin在72 h后转录水平也有相应程度下调，与对照处理差异不显著(P<0.058 2)；免疫基因lebocin在72 h后转录水平也有相应程度下调，与对照处理差异显著(P<0.045 5)。图3，图4

图3Burs-βdsRNA注射幼虫后不同时间内干扰效果检测
Fig.3 Effect ofburs-βexpression level ofHelicoverpaarmigeraafter treatment withburs-βdsRNA at different times

图4 5龄幼虫注射burs-βdsRNA 72 h后棉铃虫免疫相关基因转录水平变化
Fig.4 Related immune genes transcript level of fat body tissue in 5thlarval instar after 72 h injection withburs-βdsRNA

3 讨 论

以棉铃虫为研究对象，以实验室保存的形成的同源二聚体为外源激素，体外处理棉铃虫5龄幼虫脂肪体组织，发现处理后棉铃虫脂肪体内免疫相关基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin在0.5 h内转录水平迅速上升，随后恢复处理前转录水平。为验证Burs-β重组蛋白体外处理幼虫脂肪体引起的相关免疫基因变化等现象，并探究这种转录水平上变化是否是因该激素直接引起，接下来体外合成了burs-β双链RNA，注射幼虫腹足，在确保72 h后幼虫体内Burs-βmRNA因降解而下调后，利用qRT-PCR分别检测了脂肪组织中cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin表达水平。结果发现cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin和lebocin转录水平随着Burs-βmRNA干扰下调而显著下降，而moricin变化并不显著。结果表明，一定浓度鞣化激素的刺激激活了免疫相关基因的迅速响应与高水平表达。而当鞣化激素水平相对较低时，大部分免疫相关基因响应该激素的影响而降低表达水平，表明Burs-β的沉默能够显著抑制棉铃虫幼虫体内部分免疫相关基因的表达。

鞣化激素有α同源二聚体、β同源二聚体和β异源二聚体，除了其在表皮鞣化和翅的伸展方面的典型功能之外，组成鞣化激素的每个亚基还具有各自独立的功能与作用[4,22]。Zhang 等[21]发现在埃及伊蚊Aedesaegypti中，鞣化激素通过其受体 Relish2 诱导抗菌肽基因的表达，从而有效地抑制体外细菌的生长，起到预防性免疫作用。也有研究表明，Burs-β组成的同源二聚体经由 IMD 路径，通过激活转录因子Relish，调控免疫反应。但其同源二聚体可能是通过新的受体来调控抗菌肽的表达[4]。

昆虫体内，抗菌肽主要由脂肪体和血细胞合成，在其他部位也有少量的合成[22]，以幼虫脂肪体为研究对象，在取样以及快速研究抗菌肽在转录水平上受鞣化激素影响方面提供了较为快捷的便利。

4 结 论

鞣化激素Burs-β组成的同源二聚体体外处理棉铃虫幼虫脂肪组织激活了免疫相关基因的迅速响应与过量表达。而利用RNAi技术注射幼虫活体，当鞣化激素基因转录由于干扰受到抑制、激素水平相对较低时，大部分免疫相关基因响应该激素的刺激而降低各自表达水平，Burs-β的沉默能够显著抑制棉铃虫幼虫体内部分免疫相关基因的表达。