棉花苗期根腐类病害生防细菌的筛选与鉴定

杜鹏程，刘海洋，张军高，李 进，周小云，刘梦丽，雷 斌，郭庆元

(1.新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091；3.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】我国是棉花(GossypiumhirsutumL.)生产大国和消费大国，新疆是我国最大的优质棉生产基地。2018年新疆棉花种植面积占全国的74.3%，产量占全国的83.8%，单产、总产稳居全国首位[1]。新疆土壤、气候条件与内地差异大，棉花苗期病害发生及危害特点与内地其他棉区不同[2]。由于常年连作、早春“倒春寒”频繁发生等因素导致新疆棉花病害发生日益严重[3-4]，致使田间出苗、保苗差，缺苗断垄普遍发生，严重影响产量和品质，筛选对棉花苗期根腐类病害具有较强拮抗作用的生防细菌，对防治棉花苗期根腐类病具有重要意义。【前人研究进展】以往主要通过化学农药处理种子的措施防治棉花苗期病害，但随着化学农药的长期使用，存在有害生物抗药性强，农药防效低、用量大、利用率低、污染环境重等弊端。生物农药具有选择性强、有害生物不易产生抗药性、环保等优点，从棉花、小麦根际土壤、植株中分离出枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等生防菌株对棉花枯萎病、黄萎病病原菌具有良好的拮抗作用[5-9]。【本研究切入点】对于棉花苗期立枯病和红腐病的相关研究较少。棉花苗期根腐类病害研究及生物防治研究基础还比较薄弱、可借鉴少，周扬等[10]研究发现新疆棉花苗期根腐类病害主要为立枯病和红腐病，其致病菌为立枯丝核菌(R.solani)、拟轮枝镰孢霉(F.verticilliodes)等。研究筛选与鉴定棉花苗期根腐类病害生防细菌。【拟解决的关键问题】从土壤、植株中分离、筛选出对棉花根腐类病害抑菌活性强的生防菌株。通过对新疆棉田土壤中分离出的有益生防菌株进行筛选、鉴定、抑菌能力测定，以及田间对棉花苗期根腐类病害生防效果验证，并通过培养，研究发酵液浸种对棉花苗期根腐类病害的防治效果。

1 材料与方法

1.1 材 料

生防菌菌株：A57、A178、M729、LB1、TWt1、TWt34、UB17-2、HBt8、HBt14、HBt26、HWt26、HWt34、LA1、LA2、LD19-1，由新疆农业科学院植物保护研究所病理实验室提供。

靶标菌：立枯丝核菌(R.solani) 、拟轮枝镰孢霉(F.verticilliodes)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)，由新疆农业大学农学院病理实验室提供。大丽轮枝菌(V.dahlia)由新疆农业科学院植物保护研究所病理实验室提供。

培养基：Luria-Bertani培养基(胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL)

马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供。

棉花品种：新陆中46号，新疆承天种业科技股份有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 生防细菌抑菌能力测定

将保存在试管中的菌株转接到平板培养基上活化培养3～5 d。采用平板对峙法，先用打孔器(6 mm)将靶标菌做成适量菌饼，采用五点法接种，将菌饼转接新的PDA培养基中央，在距培养皿边缘2 cm处用牙签进行生防细菌菌株接种。每个处理重复3次，生长3～5 d观察生长情况，测量并计算每株生防菌菌株的抑菌带宽度，并筛选出抑菌率高的生防菌株。7～15 d观察抑菌带变化情况。

1.2.2 生防细菌的分子生物学鉴定1.2.2.1 目标基因片段PCR扩增

16S rDNA 序列扩增：采用细菌16S rDNA 序列通用引物F16S-27:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和R16S-1492:TACGGYTACCTTGTTACGACTT进行扩增。反应体系为2×TaqMaster Mix 25 μL，27F (10 μmol/L)和 1 492R (10 μmol/L)各 1 μL，DNA 模板 1 μL，补dd H2O 到 50 μL。PCR 扩增条件为预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s 35 cycles，延伸72℃ 1.5 min；延伸72℃ 10 min。

gyrA 序列扩增：采用细菌gyrA基因通用引物42F: CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT和1 066R: CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT进行扩增。反应体系为2×TaqMaster Mix 25 μL，42F (10 μmol/L)和 1 066R (10 μmol/L)各 1 μL，DNA 模板 1 μL，补dd H2O 到 50 μL。PCR 扩增条件为预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s 35 cycles，延伸72℃ 1.5 min；延伸72℃ 10 min。

1.2.2.2 回收PCR产物

(1)2.0%琼脂糖凝胶电泳，切取目的片断；

(2)加入回收试剂溶液A 300 μL/0.1g，60℃水浴至胶完全溶化；

(3)加入50 μL回收试剂溶液B，混匀 ；

(4)将溶液置于离心柱中，静置5 min，12 000 r/min，1 min，弃液体；

(5)加入500 μL 80%乙醇，12 000 r/min，离心1 min，弃液体，重复1次；

(6)12 000 r/min，离心5 min，甩干余液，弃液体，晾干5～8 min；

(7)将离心柱置于新的离心管中，加入30 μL灭菌双蒸水，静置10 min；

(8)13 000 r/min，离心3 min，管底即为纯化产物，取3 μL电泳检测。

1.2.3 生防细菌田间防治效果

在新疆哈密西戈壁试验田进行，选择棉花苗期根腐类病害发病重的地块，该地块棉花立枯病和棉花红腐病为混合侵染发生。分别设不浸种空白对照、HWt34浸种、TWt34浸种、TWt1浸种、LA1浸种，共5个处理，每个处理3次重复。每个小区面积20 m2，共18个小区。在棉花苗期分别调查出苗率、发病率、病情指数和防治效果。

棉花棉期根腐类病害分级标准[11]

0级：茎基部和根部无病斑；

1级：茎基部出现少量褐色病斑，根部病斑占整个根部面积的 10%以下，或下部叶片变黄，变黄叶片占整株叶片的10%；

3级：茎基部棕褐色病斑凹陷，根部病斑占整个根部面积的11%～25%，变黄萎蔫叶片占整株叶片的25%；

5级：茎基部病斑棕褐色扩展，茎基部变细，根部病斑占整个根部面积的26%～50%，变黄萎蔫叶片占整株叶片的50%；

7级：茎基部黑褐色病斑绕茎1周， 缢缩变细，根部病斑占整个根部面积的51%～75%，变黄萎蔫叶片占整株叶片的75%；

9级：整株萎蔫造成死亡。发病率 (%) =发病株数/调查总株数×100%。

病情指数=∑ (各级病株数×相对级数值) / (调查总株数×6) ×100。

防治效果 (%) = (空白对照病情指数-药剂处理病情指数) /空白对照病情指数×100%。

1.3 数据处理

所得 PCR 产物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司进行序列测定，测得的序列经在NCBI 进行 BLAST 在线同源比对，选用同源性较高的标准菌株作为参照对象，利用 Bioedit和MEGA 7.0 软件进行序列编辑和多序列比对，采用邻接法(Neighbor-joining method)构建系统发育树。数据分析统计，试验数据通过Microsoft Office Execl 2010整理，利用SPSS 21.0软件，用Duncan′s新复极差法进行方差分析，比较各处理之间的差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 生防细菌抑菌能力

研究表明，生防菌株TWt34和HWt34抑菌能力较强，对立枯丝核菌的抑菌带宽度分别为8.14 和8.29 mm，对拟轮枝镰孢霉分别为6.20 和6.60 mm，对尖孢镰刀菌分别为7.63和7.70 mm，对大丽轮枝菌的抑菌宽度最大分别为12.60和13.15 mm。与其它生防菌有明显的差异。图1

1.立枯丝核菌; 2.拟轮枝镰孢霉; 3.尖孢镰刀菌; 4.大丽轮枝菌的拮抗作用
1Rhizoctoniasolani2Fusariumverticilliodes3Fusariumoxysporum4Verticilliumdahliae
图1 生防菌TWt34、TWt1、LA1拮抗作用
Fig. 1 Antagonistic Effects of Bacteria TWt34, TWt1, LA1

2.2 生防菌株的分子生物学鉴定

HWt34和TWt34 2株生防菌株通过 16S r DNA 扩增进行DNA测序，序列长度分别为1 443和1 433 bp。基因序列在 NCBI 中进行 BLAST 序列同源性比较，构建系统发育树。结果显示， HWt34与B.mojavensis(AB021191.1)、B.mojavensis(JX126863.1) 处于同一支，TWt34菌株与Bacilluspseudomycoides(ACMX01000133.1) 处于同一支。 通过gyrA 基因扩增进行 DNA测序，序列长度分别为 1 012 和1 006 bp。基因序列在 NCBI 中进行 BLAST 序列同源性比较，HWt34、TWt34与B.mojavensis的gyrA 基因序列最为相似，同源性达 99%。系统发育树结果表明,HWt34、TWt34处于同一分支且与B.mojavensis处于同一个分支。生防菌株HWt34和TWt34可以确定为B.mojavensis。表1，图2～4

表1 生防细菌平板对峙抑菌带宽度Table 1 Bandwidth of antagonistic bacteriostasis of Biocontrol Bacterial plate

注：表中数据为平均数 ± 标准差，不同小写字母表示差异显著P<0.05
Note: Data in the table are mean±SD, different lowercase letters marked in the columns indicate significant difference in the tableP<0.05

图2 菌株 TWt34和HWt34 16S rDNA 和gyrA 基因的扩增结果
Fig.2 Amplification of strains TWt34 and HWt34 16S rDNA andgyrA genes

图3 基于 16S rDNA 序列 BLAST 结果构建的菌株 TWt34和HWt34 的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic trees of strains TWt34 and HWt34 were constructed based on BLAST results of 16SrDNA sequence

图4 基于gyrA 序列 BLAST 结果构建的菌株 TWt34和HWt34 的系统发育树
Fig.4 The phylogenetic tree of strains TWt34 and HWt34 based on the results ofgyrA gene sequence

2.3 生防菌株田间防治效果

研究表明，生防菌株HWt34浸种处理出苗率最高为81.81%，TWt34浸种处理出苗率次之为83.63%，两者之间没有显著性差异。生防菌株TWt1浸种处理出苗率为70.74% ，生防菌株HWt34、TWt34处理相比差异性显著，但高于生防菌株LA1处理和空白处理；空白处理发病率明显高于其它处理，其中生防菌株HWt34和TWt34浸种处理发病率较低且无明显差异；生防菌株HWt34和TWt34浸种处理的病情指数低于其它处理，而两者之间并无明显差异，但与TWt1浸种和LA1浸种处理有差异；生防菌株HWt34和TWt34浸种处理防治效果分别为78.43%、76.47%，防治效果高于生防菌株TWt1和LA1浸种处理，且差异性显著。表2

表2 生防菌株TWt34和HWt34浸种田间防治效果 Table 2 Field control effect of soil-resistant strains TWt 34 and HWt 34

注：表中数据为平均数 ± 标准差，不同小写字母表示差异显著P<0.05
Note: Data in the table are mean±SD, different lowercase letters marked in the columns indicate significant difference in the tableP<0.05

3 讨 论

生物农药具有选择性强、有害生物不易产生抗药性等优点，能够克服化学农药抗药性强、污染重等[12]。许多研究通过在植物体内、深海微生物、根际土壤中分离得到多种具有防病或诱导抗病的生防细菌[13-14]，包括Bacillus属[15]、Pseudomonas属[16]、Agrobacterium属[17]和Paenibacilluspolymyxa[18-19]等，其中Bacillus属研究最为广泛，而枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是Bacillus属的常见代表，刘海洋等[20-22]研究发现，Bacillus属其他细菌种类如解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)等棉花枯萎病和黄萎病具有良好拮抗作用，但是对于棉花苗期立枯病和红腐病的相关研究较少。新疆属于典型的大陆型气候，土壤、气候条件独特决定了微生物种类的特殊性，因此，迫切需要结合新疆实际，加强防治立枯病和红腐病等棉花苗期根腐类病害的生防菌研究。

李振东等[23-24]在高寒植物珠芽蓼和矮生嵩草中成功分离出的内生菌莫海威芽孢杆菌，并通过试验证明其对玉米小斑病菌、立枯丝核菌等具有拮抗作用并对植物的生长具有促生作用，现已成为具有巨大潜力的新型生物农药来源[25]。

研究通过鉴定棉田根际土壤筛选出的生防细菌，并且利用2种分子学鉴定方式得到1株莫海威芽孢杆菌，试验证明莫海威芽孢杆菌对棉花立枯丝核菌(R.solani) 、拟轮枝镰孢霉(F.verticilliodes)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)及大丽轮枝菌(V.dahlia)都有拮抗作用，这与前人研究结果一致，但其作用机理、应用技术尚待进一步深入研究。

B.mojavensisTWt34对棉花苗期根腐类病害具有很好的防治效果，该生防细菌选自新疆棉花根际土壤，能够较好的适应新疆生态环境，应用前景广阔。

4 结 论

生防细菌HWt34和TWt34经16S rDNA和gyrA鉴定为莫海威芽孢杆菌B.mojavensis，对棉花苗期主要根腐类病害立枯病、棉花红腐病具有较强拮抗作用。B.mojavensisHWt34浸种处理效果最好，B.mojavensisTWt34浸种处理次之，防病效果分别为78.43%和76.74%，棉田出苗率分别为84.81%和83.63%，均优于对照。