3种生防制剂对棉花红腐病和立枯病的防效评价

李 慧，刘保军，吴 琼，郭庆元

(新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】我国既是棉花的生产大国，同时也是棉花的消费大国。新疆已成为我国最大的棉花生产基地[1]。发展棉花生产，提高棉花产量一直是新疆区域经济发展的重点，同时也是增加农民收入，促进农业经济发展的重点产业[2]。目前新疆棉花产业的发展重点是提质、增效、双减。但在棉花的种植过程中遇到多种病害的侵扰，对棉花的产量和品质造成了极大的影响，同时带来化学农药的过量使用。依据多年的调查和相关报道新疆棉区常年实施防治的主要棉花病害为土传性病害，包括棉花立枯病、红腐病、枯萎病和黄萎病等。这些遍布我国广大棉区病害的常年发生导致棉花每年损失皮棉约36×104t，价值70×108元，并显著影响到棉花纤维质量[3]。【前人研究进展】目前针对这些病害主要防治措施是以使用化学农药为主的种子处理和种子包衣。此措施的普遍实施对上述病害，尤其是苗期立枯病和红腐病的起到了很好的控制作用[4]。但也带来对特定化学农药的依赖和可能出现抗药性的问题。摸索替代农药的方法和技术，采用生物技术手段开展防病实践的试验性工作正在大力开展[5、6]。以生物技术手段防治农田有害生物的措施正大量应用于农业生产，成为人类依靠科技进步向病虫草害做斗争的重要措施之一[7]。包括以菌抑病，如生防链霉菌对棉花黄萎病的防治等[8、9]。以及抗生素和植物源农药的利用，如：阿维菌素、苦参碱等。戴宝生[10]曾研究得出乙蒜素在稀释倍数为1 500倍时，对棉花黄萎病防效达38.65%，10×108/g的枯草芽孢杆菌在稀释倍数为100倍时，对棉花黄萎病防效达65.65%。这些技术措施主要利用了生物物种间的相互关系，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物；最大优点是不污染环境，是替代化学农药防治，减少农药残留，保护环境的重要方法[11-13]。【本研究切入点】当前针对棉花苗期病害，普遍采用了化学农药包衣，病害得到一定的控制。随着化学农药减施增效政策的实施与推进，枯草芽孢杆菌类生防制剂正在许多作物病害防治上开展研究与示范，乙蒜素在许多防病试验包括在棉花苗期病害大田示范上均取得良好效果。研究几种针对棉花苗期病害的生防制剂防病效果及其防病增产效益。【拟解决的关键问题】选择3种有一定应用基础的生物性制剂为材料，通过对立枯病菌和红腐病菌的毒力测定、对出苗率的影响及种子处理后的室内和田间试验，分析比较各自的防病效果和田间防病增产效果和效益，筛选替代化学农药的制剂。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

供试菌株均是从新疆棉花病样中分离、纯化得到的，经过致病力测定后确定为致病力较强的菌株，编号分别为RHBBT、RSWXD、RJHBBT的3个引起立枯病的立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)菌株和编号分别为FBYL15-111、FKYPH15-111、FKYC15-111的3个引起红腐病的拟轮枝镰孢霉(Fusariumverticillioides)菌株，6个菌株均由新疆农业大学农学院植物病理实验室提供。

1.1.2 供试棉花品种

供试菌株为适合新疆北部种植的早熟品种新陆早46号。

1.1.3 供试制剂

因市面生防制剂流通供应品种稀少，选择市场所有的几种生防制剂，分别为100×108/g枯草芽孢杆菌和80%乙蒜素[14-16]，24%植物免疫增产蛋白。表1

表1 供试制剂Table 1 Test pesticides

1.2 方 法

1.2.1 接 种

使用麦粒接种法人工接种致病菌[17]。选用新鲜成熟无破损的麦粒挑除杂质，清洗干净在清水中浸泡10～15 h，再次清洗后蒸熟，不破粒即可，捞出后冷却以每瓶100 g装入250 mL的锥形瓶中，每瓶加入10%葡萄糖液2 mL，放入122℃高压灭菌锅中60～90 min；采用打孔器从培养好的立枯丝核菌和尖孢镰孢霉6个菌株上打取菌饼，每个锥形瓶中放入4个菌饼在25℃下进行单一菌株的接种培养，6 d后摇晃菌种瓶，加快发菌速度。

1.2.2 试验设计1.2.2.1 室内毒力试验

参照制剂推荐使用浓度的中浓度对3种制剂设置5个浓度梯度，并分别制成含有不同浓度制剂的平板培养基。其中80%乙蒜素设置浓度为0.4、0.2、0.1、0.05和0.025 mg/L；100×108/g枯草芽孢杆菌设置浓度为1、0.5、0.25、0.125和0.062 5 mg/L；24%植物免疫增产蛋白设置浓度为32、16、8、4和2 mg/L。每种制剂接种3个菌株，每菌株重复3次，以不加制剂处理作为对照，25℃恒温培养7 d，测量各处理各重复菌落直径，分别统计各制剂各浓度下对棉花立枯病和红腐病的抑制率。

1.2.2.2 室内盆栽试验

首先将接种好的立枯丝核菌和尖孢镰孢霉致病菌用无菌土分别稀释至菌土比0.04%和0.05%进行单一接种试验，在菌土比不变的情况下将2种致病菌混合稀释进行混合接种试验。根据制剂推荐使用量和多次预试验的基础上设置24%植物免疫增产蛋白、80%乙蒜素、100×108/g枯草芽孢杆菌拌种浓度为100倍(10 g/L)、300倍(3.3 g/L)、500倍(2.0 g/L)、700倍(1.4 g/L)、900倍(1.1 g/L)5个浓度梯度，按制剂与种子质量比1∶80进行拌种以不拌种作为对照试验，其中每个处理3个重复。选用直径为10 cm的小花盆，以每盆20粒种子进行栽种。7 d后统计出苗情况，并定苗，三叶期时统计病害发生情况。

1.2.2.3 田间小区试验

试验地点为三坪农场，试验田面积为190 m2，时间为2019年5～9月。以15 m长作为一个小区，为减少田间浇水、通风、透光等多种自然因素造成试验误差，采用穿插法将每个处理的重复间隔开来，按照每穴2粒棉种播种，覆土。

每种生防制剂设置1个拌种处理，根据室内接种试验结果设置24%植物免疫增产蛋白拌种浓度为500倍，80%乙蒜素拌种浓度为300倍，100×108/g枯草芽孢杆菌拌种浓度为500倍，以不拌种作为对照处理，每个处理设置3个重复，并在子叶期、一叶期、三叶期、六叶期、蕾铃期5个阶段分别调查统计病害发生情况。

病情指数(%)=

病害防效=

1.2.3 病情分级标准

参考潘月敏[18]建立的红腐病和龚双军等[19]建立的立枯病情分级标准，建立2种病单独发生或混合发生情况下通用的分级标准。表2

1.3 数据处理

根据制剂有效成分浓度( mg/L)的对数值为自变量(x)，抑制率机率值为因变量(y)，运用SPSS计算出各制剂的毒力回归方程、相关系数(R)和EC50。

表2 棉花红腐病和立枯病的病情分级标准Table 2 The classification standard of cotton Fusarium red rot and Rhizoctonia damping off

2 结果与分析

2.1 3种生防制剂对棉花立枯病菌和红腐病菌的毒力

研究表明，80%乙蒜素对棉花立枯病和红腐病菌抑制中浓度最低，对立枯病菌时EC50为0.134 mg/L，对红腐病菌时EC50仅为0.122 mg/L；100×108/g枯草芽孢杆菌对2种病原菌的抑制中浓度次之，对红腐病菌时EC50为1.524 mg/L，对立枯病菌时EC50为1.904 mg/L；24%植物免疫增产蛋白抑制中浓度最大，对红腐病菌时EC50为6 088.126 mg/L,对立枯病菌时EC50为35 147.087 mg/L。80%乙蒜素对棉花立枯病菌和红腐病菌的毒力优于100×108/g枯草芽孢杆菌，24%植物免疫增产蛋白对棉花立枯病菌和红腐病菌毒力极小。表3

表3 3种生防制剂对立枯丝核菌和拟轮枝镰孢霉的抑制效果比较Table 3 Comparison of inhibitory effects of three biocontrol agents on Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum

2.2 室内人工接菌后不同浓度3种制剂的防效比较

研究表明，3种生防制剂处理对棉花出苗均有一定的促进作用，无不利影响，三者之间差异不明显。至三叶期时，3种生防制剂不同浓度处理均能显著降低立枯病的发病率和病情指数；3种生防制剂中80%乙蒜素效果最为明显，病情指数在7.5%～22.8%，100×108/g枯草芽孢杆菌次之，病情指数在11.5%～26.1%，24%植物免疫增产蛋白在3种制剂中防病作用相对较差，病情指数在17.7%～27.8%；3种制剂不同浓度间的防病作用差异明显，均以100倍处理效果较好；其中80%乙蒜素100倍处理防效最高，达76.9%，100×108/g枯草芽孢杆菌100倍处理防效次之，防效为64.6%，24%植物免疫增产蛋白100倍处理防效相对较低，为45.4%。3种制剂对棉花立枯病均有一定防效，但各制剂防效差异明显，80%乙蒜素最好，100×108/g枯草芽孢杆菌次之，可在田间验证的基础上用于田间棉花立枯病的防治。表4，图1，图2

图1 3种生防制剂不同浓度拌种处理下棉花种子出苗率变化
Fig.1 Effects of different concentrations of three biocontrol preparations on seedling emergence rate of cotton

表4 人工接菌后3种制剂不同浓度处理下的立枯病菌病情比较
Table 4 Comparison of three preparations under different concentrations of artificial exposure torhizoctoniasolanacearum

稀释倍数(倍)Dilutionfactor浓度Concentration(g/L)病情指数(%)Diseaseindex24%植物免役增产蛋白Plantimmunestimulationprotein80%乙蒜素Ethylicin100×108/g枯草芽孢杆菌BacillussubtilisⅠⅡⅢ xⅠⅡⅢ xⅠⅡⅢ x1001017.320.215.617.7Aa6.78.17.77.5Aa10.214.310.011.5Aa3003.317.719.217.418.1Aa9.68.48.18.7Aa12.112.510.811.8Aa5002.016.619.418.318.1Aa7.48.58.48.1Aa11.812.711.812.1Aa7001.422.025.129.725.6Bb14.615.216.715.5Bb22.422.025.223.2Bb9001.127.129.327.027.8Bb21.327.219.922.8Cc26.225.027.126.1BcCKⅠ30.3Ⅱ35.4Ⅲ31.8平均32.5

注：表中平均一列中的不同大写字母表示在P<0.01水平的差异显著；不同小写字母表示在P<0.05水平的差异显著
Note: The difference of different uppercase letters in the average column of the table was significant atP< 0.01 level, and that of different lowercase letters was significant atP< 0.05 level

图2 人工接菌后3种制剂不同浓度处理下棉花立枯病防效
Fig.2 Control effect of three preparations on cotton blight at different concentrations after artificial exposure

研究表明，3种生防制剂不同浓度处理均能显著降低红腐病的发病率和病情指数；3种生防制剂中80%乙蒜素效果最为明显，病情指数在6.2%～24.7%，100×108/g枯草芽孢杆菌次之，病情指数在11.4%～29.8%，24%植物免疫增产蛋白在3种制剂中防病作用相对较差，病情指数在17.6%～33.2%；3种制剂不同浓度间的防病作用差异显著，均以100倍处理效果较好；其中80%乙蒜素100倍处理防效最高，达83.9%，100×108/g枯草芽孢杆菌100倍处理防效次之，防效为70.4%，24%植物免疫增产蛋白100倍处理防效相对较低，为54.4%。3种制剂对棉花红腐病均有一定防效，但各制剂防效差异明显，80%乙蒜素最好，100×108/g枯草芽孢杆菌次之，可在田间验证的基础上用于田间棉花红腐病的防治。表5，图3

表5 人工接菌后3种制剂不同浓度处理下红腐病病情比较Table 5 Comparison of Red Rot under different concentrations of three preparations after artificial exposure

注：表中平均一列中的不同大写字母表示在P<0.01水平的差异显著；不同小写字母表示在P<0.05水平的差异显著
Note: The difference of different uppercase letters in the average column of the table was significant atP< 0.01 level, and that of different lowercase letters was significant atP< 0.05 level

图3 室内接菌后3种制剂不同浓度处理下棉花红腐病防效
Fig.3 Control effect of three preparations on Cotton Red Rot under different concentrations of Indoor bacteria exposure

研究表明，3种生防制剂不同浓度处理均能显著降低2种病害的发病率和病情指数；3种生防制剂中80%乙蒜素效果最为明显，病情指数在7.1%～21.8%，100×108/g枯草芽孢杆菌次之，病情指数在11.4%～26.0%，24%植物免疫增产蛋白在3种制剂中防病作用相对较差，病情指数在16.7%～27.9%；3种制剂不同浓度间的防病作用差异显著；其中80%乙蒜素300倍处理防效最高，达79.4%，100×108/g枯草芽孢杆菌100倍处理防效次之，防效为66.6%，24%植物免疫增产蛋白100倍处理防效相对较低，为49.8%。3种制剂对棉花立枯病和红腐病均有一定防效，但各制剂防效差异明显，80%乙蒜素最好，100×108/g枯草芽孢杆菌次之，可在田间验证的基础上用于田间棉花立枯病和红腐病的防治。表6，图4

研究表明，3种制剂在拌种稀释倍数为100、300和500倍之间的防病效果无显著性差异，除80%乙蒜素在500倍液处理时的两病兼防效果略低外，其余均在极显著水平上无差异。兼顾高效和最大可能减少制剂的用量，在田间试验时80%乙蒜素选择300～500倍液拌种比较适宜；100×108/g枯草芽孢杆菌和植物免疫增产蛋白均选择500倍液拌种比较适宜。表6，图4

表6 人工接菌后3种制剂不同浓度处理下立枯病和红腐病的混合病情 Table 6 Mixed disease of Rhizoctonia solani and red rot under different concentrations of three agents after artificial inoculation

注：表中平均一列中的不同大写字母表示在P<0.01水平的差异显著；不同小写字母表示在P<0.05水平的差异显著
Note: The difference of different uppercase letters in the average column of the table was significant atP< 0.01 level, and that of different lowercase letters was significant atP< 0.05 level

图4 人工接菌后3种制剂不同浓度处理下立枯病和红腐病的兼防效果
Fig.4 Effect of different concentrations of three preparations on the control ofRhizoctoniasolani and Red Rot after artificial exposure

2.3 3种生防制剂对立枯病和红腐病的田间兼防效果

研究表明，3种生防制剂拌种处理立枯病和红腐病均有较不同程度的兼防效果，三叶期的防效与实验室的结果大致一致。从子叶期至蕾铃期，3种制剂处理后总的趋势是以三叶期为转折，病情在此前渐增，此后缓慢减轻，而防效在此前渐减，此后略增，变化不大。三叶期为病害发生最为重时期。对立枯病和红腐病两病发生高峰期(三叶期)及病情停止增长后(蕾铃期)的田间防效统计表明，3种制剂之间对立枯病和红腐病的综合防效差异显著，3种制剂中，防效最好的制剂是80%乙蒜素，三叶期综合防效为62.3%，100×108/g枯草芽孢杆菌次之，三叶期综合防效为53.8%，24%植物免疫增产蛋白三叶期综合防效相对较低，仅为35.6%，3种制剂至蕾铃期的防效均与三叶期比较一致，仅略增2～4个百分点，3种制剂均有较好的持效性。表7，图5

表7 3种生防制剂拌种处理下棉花各生育期立枯病和红腐病的综合防效Table 7 Comprehensive control effect of seed dressing with three biocontrol preparations on blight and Red Rot in cotton at different growth stages

图5 3种生防制剂下立枯病和红腐病的田间综合防效
Fig.5 Comprehensive field control effects of three biocontrol preparations on stand blight and red rot

研究表明，3种生防剂均有一定程度的保苗增产作用；其中，80%乙蒜素增产效果最好，增幅为11.3%其次24%植物免疫增产蛋白和100×108/g枯草芽孢杆菌，增幅分别为10.4%和9.6%，按籽棉6元/kg计；3种生防制剂的直接增产效益分别为：80%乙蒜素142.2元/667 m2，24%植物免疫增产蛋白130.8元/667 m2，100×108/g枯草芽孢杆菌120.6元/667 m2。表8

表8 3种生防制剂拌种处理下籽棉产量及增产效果Table 8 Yield and yield increasing effect of seed cotton treated with three kinds of biocontrol preparations

3 讨 论

周扬[20]对南疆棉区棉花立枯病菌和红腐病菌种间及种内菌株间的致病力的比较和分析认为，在对多个品种的人工接菌调查中棉花立枯病菌的致病力均高于红腐病菌。在研究室内接种试验中，3种制剂对棉花立枯病单一防效均低于对棉花红腐病单一防效，或也与病原菌致力有关。这些结果似乎说明病原菌致病力的强弱可能与其致病过程及防病效果方面存在着一定的联系。

80%乙蒜素是我国自主研发的一种高效广谱杀菌剂，是一种植物仿生农药，具有保苗、杀菌的作用，且在蔬菜和土壤中易消解[21]；在研究中也表现出较好的室内、室外及病害兼防的效果，其防效是供试3种制剂中最好的；100×108/g枯草芽孢杆菌可分泌抗菌物质抑制病原菌生长，并使菌丝发生断裂、解体并溶解病原菌细胞壁，以致其失去扩张能力[22]，达到防病保苗增产的效果。24%植物免疫增产蛋白能明显诱导激活植物体内免疫系统，提高植物自身免疫力及抗逆能力，促进植物生长，是天然、广谱、高效环保型绿色制剂。通过测产结果可知,经过24%植物免疫增产蛋白拌种处理过的种子虽然防效不及100×108/g枯草芽孢杆菌理想，但最终产量却优于100×108/g枯草芽孢杆菌，说明该种制剂确实可以改善作物品质、达到增产增收的效果，可以与其他生防制剂复配使用。田间试验中3种制剂防效略低于室内接种试验，或因室内环境土壤、光照、温度、水分等都较为稳定，有利于病害的发展，在防与不防之间差异较大，从而导致室内防效高于田间防效。

生物防治最大的优点是不污染环境，是农药等非生物防治方法所不能比拟的。对3种生防制剂进行了比较分析，初步显示了一些生防制剂用于棉花病害生防的应用前景。但试验缺少在相同条件下与化学农药处理的对比，是否能够替代农药并达到生产所需的保苗效果，还需进一步的验证。建议在进一步试验、示范的基础上，开展以80%乙蒜素和100×108/g枯草芽孢杆菌等生防制剂替代化学农药的应用研究。

4 结 论

供试的3种生防制剂对棉花苗期立枯病和红腐病均有一定的防病增产效果:其中80%乙蒜素最佳，室内和田间均对立枯病和红腐病具有较好单一防病效果和兼防效果，室内防效约为76.9%～83.9%，田间防效约62.3%～77.8%，增产幅度约11%；100×108/g枯草芽孢杆菌次之,室内防效约为64.6%～70.4%，田间防效约53.8%～64.8%，增产幅度约9.6%；24%植物免疫增产蛋白防效较低但有一定的增产效果,室内防效约为45.4%～54.4%，田间防效约35.6%～47.3%，增产幅度约10%。