miR-33表达与炎症反应的关系

2020-04-07 03:48赵振宇
医学信息 2020年2期
关键词:微小RNA炎症因子单核细胞

赵振宇

摘要:目的  探讨miR-33表达与炎症反应的相关性。方法  细胞培养箱中培养人单核细胞(THP-1)48~72 h后传代,传至3代,加入100 ng/ml佛波醇(PMA)诱导24 h分化成为巨噬细胞。采用实时荧光定量PCR技术检测不同浓度LPS(0、1、10、100 ng/ml)以及10 ng/ml LPS不同刺激时间(0、24、36、48 h)THP-1巨噬细胞miR-33表达;另采用ELISA法检测THP-1巨噬细胞中TNF-α、IL-6和MCP-1表达量,分析miR-33表达与炎症反应的相关性。结果  随着LPS浓度(0、1、10、100 ng/ml)增加,miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加,不同浓度组miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。随着LPS刺激时间(0、24、36 h)延长,miR-33表达逐渐上调、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加,36 h达到高峰,48 h逐渐下降到正常,不同时间点miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,miR-33表达与TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相关(P<0.05)。结论  THP-1细胞中miR-33表达与其炎症反应具有一定正相关性。

关键词:内毒素脂多糖;微小RNA;炎症因子;单核细胞;脓毒症

中图分类号:R631;Q291                           文献标识码:A                                DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2020.02.020

文章編号:1006-1959(2020)02-0073-03

Abstract:Objective  To investigate the correlation between miR-33 expression and inflammatory response. Methods  Human mononuclear cells (THP-1) were cultured in a cell culture incubator for 48 to 72 h and then passaged to passage 3, and 100 ng / ml phorbol (PMA) was added to induce macrophage differentiation for 24 h.Detection of THP-1 macrophages miR-33 at different concentrations of LPS (0,1,10,100 ng/ml) and 10 ng/ml LPS at different stimulation times (0,24,36,48 h) using real-time PCR expression; ELISA was used to detect the expression of TNF-α, IL-6 and MCP-1 in THP-1 macrophages, and the correlation between miR-33 expression and inflammatory response was analyzed.Results  With the increase of LPS concentration (0,1,10,100 ng/ml), the expression of miR-33, TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels gradually increased. There were statistically significant differences in miR-33 expression, TNF-α, IL-6 and MCP- levels in different concentration groups(P<0.05).With the extension of LPS stimulation time(0,24,36 h), miR-33 expression gradually increased, TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels gradually increased, peaked at 36 hours, and gradually decreased to normal at 48 h. There were statistically significant differences in miR-33 expression, TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels at time points(P<0.05). Pearson correlation analysis showed that miR-33 expression was positively correlated with TNF-α, IL-6 and MCP-1(P<0.05).Conclusion  The expression of miR-33 in THP-1 cells has a positive correlation with its inflammatory response.

Key words:Endotoxin lipopolysaccharide;MicroRNA;Inflammatory factors;Monocytes;Sepsis

脓毒症(sepsis)是一种由细菌、病毒、真菌及寄生虫等各种病原微生物感染引起的全身性炎症反应,其本质是机体促炎性介质过度释放引起炎症反应失控,导致自身免疫性病理损伤,严重时可以发展为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1]。脓毒症临床治疗效果不佳、费用高昂,预后差,已成为重症监护室非心脏病患者死亡的主要原因。近年来基于脓毒症的病理生理,临床采用了单克隆抗体来中和TNF-α、IL-6和MCP-1等炎症因子新型生物疗法,但其治疗效果并不理想,因此有效预防、早期诊断及积极治疗脓毒症意义重大。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种广泛分布于真核细胞内以及病毒中,长度约为20~24个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子[2,3]。有研究表明[4,5],miR-33a可以调控人外周血单核巨噬细胞靶基因ABCA1的表达,参与机体脂质代谢,介导动脉粥样硬化形成。THP-1单核细胞在脓毒症的发生发展过程中起着关键作用,而目前miR-33与THP-1细胞炎症相关研究较少。本研究主要探讨miR-33与TNF-α、IL-6及MCP-1表达水平的相关性,旨在探讨其在脓毒血症进展中的意义,现报道如下。

1材料与方法

1.1细胞与试剂  研究时间:2019年2~3月。细胞:THP-1(中科院细胞生物所细胞中心);脂多糖(LPS;Sigma,美国);DMEM培养基、改良型RPMI-1640细胞培养基、Opti-MEM培养基(Gibco,美国)。试剂:TNF-α、MCP-1、IL-6 Human ELISA试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)。

1.2细胞培养及分组  细胞培养:THP-1细胞于改良型RPMI-1640细胞培养基中,37℃、5% CO2细胞培养箱中培养48~72 h后传代,传至3代,PI单染色法检测THP-1细胞存活率。將处于对数期THP-1单核细胞以密度为1×106/ml种植于6孔板中,每孔铺细胞悬液2 ml,并用100 ng/ml佛波酯(PMA)诱导24 h分化成贴壁的巨噬细胞。实验分组:①THP-1巨噬细胞随机分为4组,分别用不同浓度的LPS(0、1、10、100 ng/ml)诱导各组细胞24 h。②THP-1巨噬细胞随机分为4组,浓度为10 ng/ml LPS诱导各组细胞不同时间(0、24、36、48 h)。

1.3方法

1.3.1 miR-33表达  实时荧光定量PCR法检测miR-33表达:使用TRIzol法提取各组细胞沉淀中总RNA,紫外线分光光度定量,RNA/DNA微量分光光度计测定RNA纯度。按Invitrogen逆转录反应试剂盒说明进行RNA逆转录。cDNA合成过程采用miR-33s RT特异性构建逆转录体系,miR-33 RT引物序列:5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACUUCACG-3';内参照U6 RT引物序列:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。miR-33 PCR扩增条件为:95℃,30 min;40个扩增循环(95℃ 8 s,64℃ 10 s,72℃ 20 s)。miR-33正向引物序列:5'-GGTTAGATCTTGCTCCAGCGGTTTG-3';反引物序列:5'-GTAAAGCTTGCCCTCCTGTTTCCTG-3'。内参照U6正向引物序列:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3';反向引物序列:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3',相关引物序列均由上海吉玛制药技术有限公司提供。miR-33以U6为内参基因,相对定量用2-ΔΔCt计算,Ct值为目的基因达到设定阈值时的PCR循环次数,目的基因相对于内参基因的相对数△△Ct=(Ct靶基因-Ct内参)处理组-(Ct靶基因-Ct内参)未处理组。

1.3.2 TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平  收集各组细胞上清液,采用ELISA法检测TNF-α、IL-6和MCP-1含量,严格按照Human ELISA试剂盒内说明书进行试验操作。

1.4观察指标  比较不同浓度组(0、1、10、100 ng/ml)中miR-33表达及TNF-α、IL-6和MCP-1水平,不同时间组(0、24、36、48 h)中miR-33表达及TNF-α、IL-6和MCP-1水平,并分析miR-33与TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平的相关性。

1.5统计学方法  采用SPSS 23.0 软件进行数据分析处理,计量资料以(x±s)表示,比较采用t检验。采用Pearson相关分析miR-33与TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度组中miR-33表达比较  随着LPS浓度(0、1、10、100 ng/ml)增加,miR-33表达逐渐增加,不同浓度组中miR-33表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

2.2不同浓度组中TNF-α、IL-6和MCP-水平比较  随着LPS浓度(0、1、10、100 ng/ml)增加,TNF-α、IL-6和MCP-1水平增加,不同浓度组中TNF-α、IL-6和MCP-水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.3不同时间组中miR-33表达比较  随着LPS刺激时间(0、24、36 h)延长,miR-33表达逐渐上调,36 h达到高峰,48 h逐渐下降到正常,不同时间组中miR-33表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

2.4不同时间组中TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较  随着LPS刺激时间(0、24、36 h)延长,TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加,36 h达到高峰,48 h下降到正常水平,不同时间组中TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.5 miR-33与TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平相关性分析  miR-33表达与TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相关(r=0.873、0.782、0.915,P<0.05)。

3讨论

脓毒症与全身过度炎症反应关系密切,免疫细胞激活、转录因子活化、炎症因子过度释放,进而启动炎症级联反应是其发生发展的重要病理机制[6]。大量炎症介质的释放是导致全身炎症反应综合征的“中心环节”,其中IL-6和TNF-α作为快速反应炎症因子,是启动“瀑布样反应”最上游的炎症介质,一定程度上反应了病情程度以及预后[7,8]。

miRNA根据碱基互补配对原则,通过与靶基因mRNA3'末端非翻译区特异性结合降解或抑制其翻译,在转录后水平调控靶基因表达。研究表明[9],在脓毒血症发生发展的过程中,多种miRNA(miRNA-346、miRNA-147、miRNA-142-3p、miRNA-155、miRNA-9)参与了致炎基因表达的调控,从而影响炎症细胞的增殖分化以及炎症因子的产生释放。本研究结果表明,随着LPS浓度(0、1、10、100 ng/ml)增加,miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加,不同浓度组中miR-33表达、中TNF-α、IL-6和MCP-水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明LPS能够诱导THP-1细胞miR-33以及TNF-α、IL-6和MCP-1的表达,并呈现浓度依赖性。随着LPS刺激时间(0、24、36 h)延长,miR-33表达逐渐上调、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加表达逐渐上调,36 h达到高峰,48 h逐渐下降到正常,不同时间组中miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明LPS能够促进THP-1细胞miR-33以及TNF-α、IL-6和MCP-1的表达,并具有时间依赖性。Pearson相关分析显示,miR-33表达与TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相关(P<0.05),说明miR-33可能参与调节THP-1细胞TNF-α、IL-6和MCP-1的表达。

综上所述,miR-33可能参与了THP-1细胞炎症反应调控,其具体机制还有待一步研究。

参考文献:

[1]Jiang J,Du H,Su Y,et al.Nonviral infection-related lymphocytopenia for the prediction of adult sepsis and its persistence indicates a higher mortality[J].Medicine (Baltimore),2019,98(29):e16535.

[2]Jonas S,Izaurralde E.Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing[J].Nat Rev Genet,2015,16(7):421-433.

[3]Zhao Y,Wang Z,Zhang W,et al.MicroRNAs play an essential role in autophagy regulation in various disease phenotypes[J].Biofactors,2019,45(6):844-856.

[4]Price NL,Rotllan N,Zhang X,et al.Specific Disruption of Abca1 Targeting Largely Mimics the Effects of miR-33 Knockout on Macrophage Cholesterol Efflux and Atherosclerotic Plaque Development[J].Circ Res,2019,124(6):874-880.

[5]Ouimet M,Ediriweera H,Afonso MS,et al.microRNA-33 Regulates Macrophage Autophagy in Atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2017,37(6):1058-1067.

[6]Williams B,Neder J,Cui P,et al.Toll-like receptors 2 and 7 mediate coagulation activation and coagulopathy in murine sepsis[J].J Thromb Haemost,2019,17(10):1683-1693.

[7]Li C,Gu H,Yu M,et al.Inhibition of transmembrane TNF-alpha shedding by a specific antibody protects against septic shock[J].Cell Death Dis,2019,10(8):586.

[8]Feng LL,Xin WN,Tian XL.MALAT1 modulates miR-146's protection of microvascular endothelial cells against LPS-induced NF-kappaB activation and inflammatory injury[J].Innate Immun,2019:1226302131.

[9]Jiang K,Yang J,Guo S,et al.Peripheral Circulating Exosome-Mediated Delivery of miR-155 as a Novel Mechanism for Acute Lung Inflammation[J].Mol Ther,2019,27(10):1758-1771.

[10]Ho PC,Chang KC,Chuang YS,et al.Cholesterol regulation of receptor-interacting protein 140 via microRNA-33 in inflammatory cytokine production[J].FASEB J,2011,25(5):1758-1766.

[11]Yang J,Shi Y,Chen H,et al.Glycyrrhizic acid attenuates myocardial injury: Involvement of RIP140/NF-kB Pathway[J].Biomed Pharmacother,2017(95):62-67.

[12]Li H,Hou H,Liu S,et al.miR-33 and RIP140 participate in LPS-induced acute lung injury[J].Turk J Med Sci,2019,49(1):422-428.

收稿日期:2019-11-20;修回日期:2019-11-28

編辑/杜帆

猜你喜欢
微小RNA炎症因子单核细胞
MiRNA在肺癌诊断与治疗中的应用进展
胸腹腔镜微创手术与传统开胸手术对食管癌患者术后肺功能、炎症因子水平的影响
阿托伐他汀强化降脂对急性脑梗死患者疗效与炎症因子的影响
血必净治疗重症肺炎的效果观察及对炎症因子和氧化、抗氧化因子的影响
氨氯地平联合阿托伐他汀对高血压合并高血脂患者内皮功能的影响
鼻咽癌肿瘤干细胞miRNAs和 lncRNAs及mRNAs表达谱分析
单核细胞18F-FDG标记与蛛网膜下腔示踪研究
类风湿性关节炎患者外周血单核细胞TLR2的表达及意义
单核细胞增生李斯特氏菌拮抗菌的分离鉴定及其抑菌活性
单核细胞的成熟/分化有利于跨越血脑屏障和被艾滋病毒感染