TWEAK/Fn14在子宫内膜异位症中的表达及功能分析

张翠荣

河北省邯郸市中心医院妇科，河北邯郸 056001

子宫内膜异位症其病理生理改变以生长功能子宫内膜组织移位为主，临床表现上以痛经、腹盆腔慢性疼痛和性交痛为主，部分患者因此出现继发性不孕。肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂（TWEAK）属于肿瘤坏死因子配体超家族一员，其在1997年被发现随后被广泛研究[1]，基因研究称其定位于人染色体16q13[2]，是由249个氨基酸组成的一种Ⅱ型跨膜蛋白，虽然其为高度保守结构但具有广泛生物学活性。TWEAK及其受体Fn14生物学作用包括促进细胞凋亡与增殖、新生血管的形成、增加细胞侵袭能力、激活金属基质蛋白酶活性、同时还能诱导炎症性细胞因子表达增强[3]。其最主要的生物活性作用领域为肿瘤细胞的增值与凋亡[4]。目前针对TWEAK/Fn14在胃癌、结肠癌、胰腺癌以及宫颈癌、卵巢癌等恶性肿瘤中的研究较多[5]，均证实其在以上肿瘤发生发展中的有重要价值，尤其是调控肿瘤细胞凋亡及抑制炎症细胞方面，但目前极少有研究针对良性肿瘤进行研究，本研究主要探讨TWEAK/Fn14在子宫内膜异位症中的表达及其功能，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年10月～2019年4月本院收治的子宫内膜异位症患者40例为观察组，另外选取同期确诊子宫内膜癌者40例为对照组。纳入标准：（1）所有患者均经临床表现结合生化辅助检查诊断；（2）病理组织活检确诊；（3）入组前向患者及其家属进行知情告知；（4）获取单位伦理许可。排除标准：（1）妊娠和（或）哺乳期妇女；（2）明确恶性肿瘤；（3）免疫功能异常；（4）内分泌功能异常；（5）严重心肺肝肾功能异常；（6）凝血功能异常；（7）入组前1个月使用性激素或糖皮质激素治疗者；（8）签字拒绝入组者。

观察组年龄18～40岁，平均（28.3±3.1）岁，病程1～11年，平均（5.1±0.3）年，已婚者33例，未婚者7例，生育情况：已有生育者15例，无生育者25例；对照组年龄19～40岁，平均（28.4±3.0）岁，病程1～11年，平均（5.0±0.3）年，已婚者32例，未婚者8例，生育情况：已有生育者16例，无生育者24例，两组患者年龄、病程、婚姻情况及生育情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 使用材料、仪器及设备

兔抗人TWEAK/Fn14多克隆抗体（北京博尔西科技有限公司，生产批号：20160718）、2300型恒温培养基（北京福意电器有限公司，生产批号201609012）、小牛血清（北京博尔西科技有限公司，生产批号：201604B111）、17-BQ型低温冰箱（北京福意电器有限公司）、1100型高速离心机（北京福意电器有限公司）、A5型水温箱（北京福意电器有限公司）、图片凝胶成像系统（北京福意电器有限公司）、D6型酶标仪（北京福意电器有限公司）、211-FD型分光光度计（北京福意电器有限公司）以及相应试剂。

1.3 方法

术前标本均于手术术中明视下留取标本送检，术后标本获得均通过宫腔镜刮宫留取，其中TWEAK mRNA水平表达及E评分通过聚合酶链式反应（PCR，福州佳宸生物科技有限公司，批号20160312B11）技术进行，此后对获得标本中总RNA提取100mg并将其注入1mL冷凝Trizol液，电动匀浆器8000r/min震荡30s后将匀浆液移至1.5mL Eppendorf管内，随后加入氯仿200μL，电动匀浆器8000r/min震荡30s，并于4℃条件下行12000r/min离心15min，丢弃上层液并加入二倍体积异丙醇后摇均，置于-20℃冰箱内30min后置入4℃10000r/min离心15min，弃上清液后使用75%乙醇沉淀，最后于40℃条件下8000r/min离心300s，反复以上步骤后，置入65℃烘箱内烘干，并行DEPC处理后水解RNA，使用光度仪280nm及260nm定量分析。取40μg以上蛋白通过12%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜。并将其置入5%脱脂奶粉温箱内封闭及孵育120min，随后使用PEST连续洗涤3次，并加入HRP标记二抗，置于37℃室温内静置120min，再次使用PEST连续洗涤3次，行CEL显色；高倍镜下阳性染色强度（Ⅰ）评分通过免疫组化（上海国源生物技术有限公司，批号20160518）技术进行，免疫组化技术分别进行标本切片，PBS洗涤，酶染、水洗、加入抗体等过程，所有试验严格按照试验操作说明书进行。

1.4 观察指标

比较手术前后TWEAK mRNA平均水平相对表达，分析两组手术前后低倍镜下E评分和高倍镜下Ⅰ评分情况。

1.5 评价标准

TWEAK及Fn14表达水平判定[6]：通过免疫组化评分法进行，评价阳性染色细胞范围（E），通过免疫组化技术评定高倍镜下阳性染色强度（I）评分。各标本均行3张连续切片，每张切片随机选取其中5个视野，并对各视野计数100个细胞，随后取各次细胞计算平均值。其中细胞浆或细胞核膜表现为棕黄色者评定为阳性[7]，随后统计阳性率。低倍镜下E评分[8]：阳性染色细胞数比例≤20%，评定为1分，20%～50%评定为2分，51%～90%评定为3分，＞90%评定为4分；高倍镜下Ⅰ评分[9]：无、弱阳性为浅黄色、中等阳性为中黄色、强阳性为深黄色或深棕色，分别评分为1～4分。所有结果均由两名具有5年以上工作经验的病理科医师进行观察与判断。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 两组患者手术前后TWEAK mRNA平均水平相对表达比较

手术前两组TWEAK mRNA平均水平相对表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），两组术后TWEAK mRNA平均水平相对表达均高于术前（P＜0.05），术后观察组TWEAK mRNA平均水平相对表达情况显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者手术前后TWEAK mRNA平均水平相对表达比较（± s，相对值）

表1 两组患者手术前后TWEAK mRNA平均水平相对表达比较（± s，相对值）

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2.2 两组E评分比较

两组术前低倍镜下E评分比较差异无统计学意义（P＞0.05），两组术后低倍镜下E评分均低于术前（P＜0.05），术后观察组低倍镜下E评分显著低于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 两组E评分比较（± s，分）

表2 两组E评分比较（± s，分）

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2.3 两组I评分比较

两组术前高倍镜下I评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组术后高倍镜下I评分均低于术前（P＜0.05），术后观察组高倍镜下I评分显著低于对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 两组Ⅰ评分比较（± s，分）

表3 两组Ⅰ评分比较（± s，分）

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3 讨论

子宫内膜异位症简称内异症，疼痛及其导致的不孕症是最主要临床症状，疼痛表现上以痛经、下腹部疼痛及性交痛为主，其严重影响患者生活质量[10]，价值因其导致的不孕症，进一步加重对患者生活质量的影响[11]。其临床类型分为腹膜型、卵巢型、深部浸润型和其他类型四种[12]，其中盆腔发病者以卵巢型与腹膜型较为多见，重症患者则以腹膜型、卵巢型合并深部浸润型三种联合发病。对于本病的发病机制尚未完全阐明[13]。但作为具有肿瘤相关浸润性生长的疾病，其与肿瘤相关发病机制有一定关系[14]。TWEAK及其受体均为肿瘤坏死因子超家族中的一员，属于可溶性细胞因子，具有调节细胞生长与增殖、分化与凋亡以及影响机体炎症反应等作用，其在肿瘤患者中的价值已经研究十分透彻[15]。

本研究观察组为子宫内膜异位症患者，而对照组则均为经病理组织活检确诊的子宫肌瘤患者，针对两组手术前后TWEAK mRNA平均水平相对表达比较发现，手术前两组TWEAK mRNA平均水平相对表达比较差异无统计学意义，术后观察组TWEAK mRNA平均水平相对表达情况显著高于对照组。提示手术干预能有效的升高子宫内膜异位症患者TWEAK mRNA水平，进而减轻其肿瘤浸润倾向。同时针对两组手术前后低倍镜下E评分及高倍镜下Ⅰ评分比较发现，手术术后观察组低倍镜下E评分显著低于对照组，且高倍镜下Ⅰ评分显著低于对照组。提示手术干预能有效的提高子宫内膜异位症患者TWEAK/Fn14表达阳性率，对高倍镜及低倍镜检查结果均具有积极干预价值。正常细胞具有一定的自噬能力，能自我清除代谢产物及损伤细胞器，维持细胞的基本能量需求且确保细胞内环境稳态均有重要意义。对于肿瘤细胞发生发展，还具有一定的抑制效应[16]。TWEAK/Fn14均属于肿瘤坏死因子受体家族成员，能激活蛋白激酶，并与TWEAK相互结合，进而激活下游信号转录因子，从而抑制肿瘤细胞生长与增殖，激活细胞自噬效应[17]，进而提高机体抗肿瘤能力。同时还可降低机体炎症反应，缓解患者疼痛等临床症状[18]。

综上所述：TWEAK/Fn14 在子宫内膜异位症术前患者中表达水平较低，术后其表达水平显著升高，提示其在抑制病情发展，缓解子宫内膜异位症患者病情，减少其浸润性方面有重要意义。