关山樱大鼠亚慢性毒性研究

张成香 李世芬 王玉邦 张璐璐 严 婷 朱雪峰

(1. 南京医科大学公共卫生学院，江苏 南京 211166；2. 江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心，江苏 南京 211166)

关山樱俗称“红缨”，是八重樱的一个代表性品种。属于蔷薇科落叶小乔木，喜阳植物，在中国广泛栽种。樱花不仅极具观赏价值，因其含有如总黄酮[1]、多糖[2]、多酚、挥发油[3-4]、多种维生素、氨基酸和微量元素[5-6]等人体所需的丰富的药理活性物质，其食用和药用价值也被越来越多的专家学者认可，各种樱花制品如樱花果酱、樱花糕点、樱花麻薯、樱花蛋糕等制法已有相关专利[7-10]。李飞阳等[1]通过对关山樱中总黄酮含量分析及抗氧化作用研究发现，关山樱中的总黄酮对亚硝酸盐的清除作用强于传统抗氧化剂VC；杜丽娟等[11]研究表明樱花叶中的总黄酮具有较强的抗氧化活性；李友伟等[2]研究发现樱花多糖提取物也具有明显的抗氧化活性；文飞龙等[3]研究发现樱花中的挥发油对DPPH自由基、ABTS+、亚硝酸钠有明显的清除作用；徐广新等[12]通过樱花提取物对酸奶发酵特性的影响研究发现，樱花提取物的添加不仅促进乳酸菌增殖，还可抑制酸奶的后酸化,且可提高酸奶的抗氧化活性； 王瑞瑞等[13]研究发现朱樱花不仅有很强的抗氧化作用，而且还有一定的抗炎作用。虽然关于樱花的成分和活性有很多报道，但樱花是否可以食用以及长期食用安全性未见相关报道。

试验拟以关山樱为材料，SD大鼠为试验对象，经过连续13周喂养，观察其毒性作用，为其食用安全性提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

关山樱干燥花：扬州华而实食品有限公司，经研磨成黄色粉末，冷藏保存，保质期12个月；

试验动物：SPF(Specific Pathogen Free，无特定病原体)级健康离乳SD大鼠100只，雌雄各半，上海西普尔—必凯实验动物有限公司；

辐照鼠用灭菌饲料：江苏省协同医药生物工程有限公司。

1.1.2 主要仪器

电子天平：T-1000型、JJ-100型，常熟市双杰测试仪器厂；

离心机：TG1650-WS型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

显微镜：BX53型，日本奥林巴斯株式会社；

全自动生化分析仪：7100型，日立高新国际贸易有限公司；

血液分析仪：ADVIA 2120i型，西门子股份公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物饲养 动物饲养在温度为20～26 ℃、相对湿度为40%～70%的屏障环境中。

1.2.2 剂量设定、分组及饲料配制方法 关山樱人体推荐剂量人均3.0 g/d，以60 kg体重计算，受试样品掺入基础饲料百分含量最大为10%，故设高剂量为8.0 g/(kg·BW·d)(Ⅲ组)，中剂量为2.5 g/(kg·BW·d)(Ⅱ组)，低剂量为1.0 g/(kg·BW·d)(Ⅰ组)，分别相当于人体推荐剂量的160，50，20倍，另设一个未处理对照组(C1组)及一个处理对照组(C2组)均为0 g/(kg·BW·d)。按动物体重随机分成5组，每组20只，雌、雄各半。

关山樱按逐步稀释的方法掺入基础饲料中，基础饲料的营养成分为水分9.7%、粗纤维3.2%、粗脂肪5.4%、粗蛋白19.1%、粗灰分5.3%、总磷0.67%、钙1.05%。按体重的8%折算，高、中、低剂量组掺入基础饲料的百分含量分别为10.00%，3.13%，1.25%。高剂量组饲料中受试样品掺入百分含量>5%，因此处理对照组饲料中填充甲基纤维素，掺入量等同高剂量，使其与高剂量组的饲料营养素水平保持一致。同时设未处理对照组喂饲正常基础饲料[14-16]。高剂量组日粮组成为90.00%基础饲料+10.00%关山樱，中剂量组日粮组成为96.87%基础饲料+3.13%关山樱，低剂量组日粮组成为98.75%基础饲料+1.25%关山樱，处理对照组日粮组成为90.00%基础饲料+10.00%甲基纤维素，未处理对照组日粮组成为100.00%基础饲料。连续喂养13周，动物自由进食饮水。

1.2.3 方法及观察指标 每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和1次食物摄入量。试验结束时进行尿液常规检查，包括外观、尿蛋白、比重、pH值、葡萄糖、潜血等。试验结束后，隔夜禁食，逐只称重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血两份，一份用抗凝采血管采血，测其血常规指标，包括白细胞计数及其分类、血红蛋白浓度、红细胞计数、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间等，另一份用无抗凝剂的干燥管采血，离心，取血清，测其血生化指标，包括血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠等。采血之后进行大体解剖，分离脑、心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、附睾、子宫、卵巢，用生理盐水洗净，滤纸吸水后称重，分别计算各脏器相对重量(脏/体)。对处理对照组、未处理对照组和高剂量组的这些脏器用甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色后进行组织病理学检查。

1.3 试验数据统计分析

采用SPSS软件(SPSS Statistics V22.0 标准版)对原始数据进行统计，对体重、摄食量、脏器重量、血常规指标、血生化学指标和尿液指标等原始数据进行方差齐性检验，满足方差齐性要求的数据资料用采用Mean±SD进行统计描述，采用单因素方差分析及SNK法进行两两比较；对方差不齐的数据或等级数据采用秩和检验进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 关山樱对大鼠体重的影响

各组大鼠在整个试验中生长正常，试验前后体重均有增长，但各组间体重比较无统计学意义(分别统计雌雄，见表1)，提示不同剂量关山樱喂食大鼠13周对其体重并无影响。

2.2 关山樱对大鼠摄食量的影响

喂养期间，经口给予大鼠不同剂量的关山樱13周，各组摄食量经方差分析及SNK法两两比较，仅在第7周2.5 g/(kg·BW·d)组雌性大鼠(Ⅱ组)低于未处理对照组(C1组，P<0.05)。其余时间段及其他各组间雌雄分别比较均无统计学意义(P>0.05，见表2)，提示关山樱喂养大鼠对其摄食量影响不明显，偶可见摄食量减少。

2.3 关山樱对大鼠尿常规指标的影响

试验结束时，尿常规检查尿液外观、尿蛋白、比重、pH、葡萄糖、潜血。采用秩和检验进行统计处理，各组间雌雄分别统计，差异均无统计学意义(P>0.05，见表3)，提示关山樱喂养大鼠对尿常规无明显影响。

表1 关山樱对大鼠体重的影响

表2 各组大鼠摄食量的比较†

† *表示与C1组比较，P<0.05。

表3 关山樱对大鼠尿常规指标的影响†

† “-”表示阴性；“+-”表示弱阳性；“+”表示阳性。

2.4 关山樱对大鼠血常规指标的影响

经口给予大鼠不同剂量的关山樱第13周，测定各剂量组大鼠血液红细胞计数、血红蛋白水平、白细胞计数及其分类等、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间等指标。采用单因素方差分析以及SNK法进行两两比较方法进行统计处理。各组间雌雄分别统计，各项指标组间比较差异均无统计学意义(P>0.05，见表4)，提示关山樱喂养大鼠对血常规无明显影响。

表4 关山樱对大鼠血常规指标的影响

2.5 关山樱对大鼠血生化指标的影响

经口给予大鼠不同剂量的关山樱第13周，生化指标检查发现，除雄性大鼠尿素指标2.5 g/(kg·BW·d)组(Ⅱ组)低于未处理对照组(C1组)外，其余血生化指标差异均无统计学意义(P>0.05，见表5)，提示关山樱喂养大鼠对生化指标(包括肝肾功能、血糖血脂、血电解质)无明显影响。

表5 关山樱对大鼠血生化指标的影响

† *表示与C1组比较，P<0.05。

2.6 关山樱对大鼠脏器绝对重量及相对重量的影响

由表6可见，各剂量组主要脏器绝对重量及相对重量，组间差异均无统计学意义(P>0.05)，提示关山樱喂养大鼠对重要脏器重量无明显影响。

2.7 组织病理学检查

各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常变化。病理组织学检查(图1)发现，C1组肝脏轻微脂肪变性3例，C2组肝脏轻微脂肪变性4例，Ⅲ组肝脏轻微脂肪变性1例，其他器官组织均未见异常病理改变。由此可见，未见关山樱引起的SD大鼠各脏器毒性病理改变，无损害作用。

图1 C1组和Ⅲ组SD大鼠的脏器组织石蜡切片观察结果

表6关山樱对大鼠脏器重量的影响

Table6EffectofCerasuslannesianaalbo-roseaonvisceraweightinrats(n=10)

性别组别停食后体重/g肝重/g肝/体/%脾重/g脾/体/%肾重/g肾/体/%C1组274.8±29.77.14±0.892.61±0.240.51±0.050.19±0.021.69±0.120.62±0.07Ⅰ组259.4±16.86.75±0.472.60±0.090.48±0.060.18±0.021.68±0.130.65±0.03雌Ⅱ组248.3±28.56.23±0.732.51±0.140.49±0.110.20±0.041.55±0.170.63±0.05Ⅲ组253.7±25.46.50±0.702.56±0.140.48±0.060.19±0.031.58±0.170.63±0.05C2组231.2±30.26.20±0.732.69±0.210.47±0.060.21±0.021.54±0.170.67±0.06C1组527.2±29.713.54±1.172.57±0.180.82±0.080.16±0.023.08±0.250.58±0.04Ⅰ组490.8±37.013.18±1.362.68±0.150.84±0.060.17±0.023.01±0.220.61±0.03雄Ⅱ组502.2±45.813.32±1.802.65±0.170.80±0.070.16±0.022.89±0.180.58±0.05Ⅲ组459.9±31.811.79±1.722.58±0.430.71±0.080.16±0.032.83±0.330.62±0.08C2组437.8±37.811.40±1.052.61±0.140.70±0.110.16±0.032.58±0.160.59±0.04性别组别性腺重/g性腺/体/%脑重/g脑/体/%心重/g心/体/%胸腺重/gC1组0.15±0.020.06±0.011.74±0.110.64±0.080.97±0.140.36±0.040.42±0.13Ⅰ组0.14±0.020.05±0.011.76±0.070.68±0.050.88±0.050.34±0.020.40±0.09雌Ⅱ组0.12±0.010.05±0.011.69±0.110.69±0.060.86±0.080.35±0.040.38±0.09Ⅲ组0.13±0.030.05±0.011.71±0.080.68±0.070.88±0.120.35±0.030.37±0.07C2组0.14±0.020.06±0.011.52±0.110.67±0.080.81±0.090.35±0.040.35±0.08C1组3.00±0.140.57±0.052.17±0.150.41±0.021.64±0.080.31±0.020.65±0.16Ⅰ组3.00±0.270.61±0.082.03±0.100.41±0.031.63±0.140.33±0.030.58±0.14雄Ⅱ组3.02±0.410.60±0.101.99±0.050.40±0.041.59±0.160.32±0.030.60±0.14Ⅲ组2.88±0.140.63±0.061.96±0.070.43±0.041.49±0.180.33±0.030.47±0.09C2组2.58±0.230.59±0.051.87±0.120.43±0.041.46±0.160.33±0.040.45±0.05性别组别胸腺/体/%肾上腺重/g肾上腺/体/%子宫重/g子宫/体/%附睾重/g附睾/体/%C1组0.15±0.040.068±0.0110.025±0.0040.53±0.240.20±0.11Ⅰ组0.16±0.030.051±0.0130.020±0.0050.53±0.150.21±0.06雌Ⅱ组0.15±0.030.053±0.0140.022±0.0080.56±0.120.23±0.05Ⅲ组0.15±0.030.049±0.0070.020±0.0030.48±0.110.19±0.04C2组0.15±0.020.058±0.0190.025±0.0090.55±0.200.24±0.09C1组0.12±0.030.056±0.0160.011±0.0031.22±0.130.23±0.03Ⅰ组0.12±0.030.063±0.0080.013±0.0021.27±0.070.26±0.03雄Ⅱ组0.12±0.030.058±0.0130.012±0.0021.15±0.210.23±0.05Ⅲ组0.10±0.020.047±0.0130.010±0.0021.08±0.100.24±0.03C2组0.10±0.010.051±0.0190.012±0.0031.09±0.100.25±0.02

3 结论

给予SD大鼠人体推荐剂量160倍的关山樱，未观察到有害作用，表明亚慢性毒性是安全的。但试验仅从长期毒性试验方面对关山樱的安全性作了探讨，在此基础上，还可开展遗传毒性试验、功能性试验，为关山樱的食用安全性和功效性提供更多的数据支持。